一、類器官介紹
? ? ? ?類器官（organoids）指利用成體干細胞或多能干細胞進行體外三維（3D）培養而形成的具有一定空間結構的組織類似物。盡管類器官并不是真正意義上的人體器官，但能夠在結構和功能上模擬真實器官，重現對應器官的部分功能，從而提供一個高度生理相關系統。類器官能夠最大程度地模擬體內組織結構及功能并能夠長期穩定傳代培養。
? ? ? ?目前3D類器官培養技術已經成功培養出大量具有部分關鍵生理結構和功能的類組織器官，比如：皮膚、心臟、腎臟、肝臟、肺、小腸、大腦、胃、胰腺、內耳等。不僅包括正常器官組織類器官，還有相應腫瘤組織類器官。
? ? ? ?類器官培養系統主要包括基質膠、維持類器官生態所需因子和分化所需因子這幾個主要元素?；|膠中含有膠原、巢蛋白和纖連蛋白等，為類器官形成三維空間結構提供基質。維持類器官生態所需因子主要目的為促進細胞的增殖和抑制細胞凋亡等?；|膠可以產生類似于哺乳動物細胞基底膜的生物活性基質材料，幫助多種類型的細胞達到附著和分化。
（Heydari Z, et al. Biodes Manuf. 2021;4(4):689-716.）
? ? ? ?長期以來，科學家們都利用動物模型來進行疾病研究和藥物開發。與二維培養和動物模型相比，類器官具有巨大的優勢。類器官與2D細胞培養相比，具有更接近生理細胞組成和行為，更穩定的基因組，更適合于生物轉染和高通量篩選等優勢。與動物模型相比，類器官模型體外建模，操作簡單，可用于研究疾病發生和發展等機理。這使其成為不同實驗、建模疾病和高通量篩選的實用平臺。Nature Methods如此評價類器官技術：利用干細胞直接誘導生成三維組織模型，為人類生物學研究提供了強大的方法。
（Heydari Z, et al. Biodes Manuf. 2021;4(4):689-716.）
類器官研究應用方向
? ? ? ?類器官的研究主要集中在：神經發育，神經遷移，物種比較，腦部疾病，腦腫瘤。
（Shi Y, Wu Q, Wang X. Curr Opin Neurobiol. 2021 Feb;66:103-115.）
不同類器官中應用方向
（Heydari Z, et al. Biodes Manuf. 2021;4(4):689-716.）
二、腦類器官在腦類疾病中的研究
? ? ? ?在過去的幾年中，腦類器官系統已被廣泛用于研究人類大腦疾病。由于腦類器官經歷的培養與人類胎兒大腦的發育步驟相似，所以它們適用于模擬具有實際病因的神經發育障礙；同時，通過模擬腦類疾病的進展，可以實現藥物的篩選。
圖1. 類腦器官的發展歷程（Shi Y, Wu Q, Wang X. Curr Opin Neurobiol. 2021 Feb;66:103-115.）
類腦器官的培養流程
（Shi Y, Wu Q, Wang X. Curr Opin Neurobiol. 2021 Feb;66:103-115.）
不同腦區發育的類腦器官的培養方案
（Shi Y, Wu Q, Wang X. Curr Opin Neurobiol. 2021 Feb;66:103-115.）
利用ESCs/iPSCs培養類腦器官需：
適當的起始細胞群；
一定量的生長因子；
合適的細胞外基質。
三、病毒載體在類器官研究中的應用
病毒載體在腦類器官中應用
? ? ? ?在體外培養的hCOs（人皮層類器官）中異位表達ETV2[ETS（E-twenty six）變型2]轉錄因子，出現了復雜的功能性血管網絡，獲得與人血腦屏障十分類似的結構vhCOs（血管化人皮層類器官）。
? ? ? ?病毒載體：慢病毒（LV-FUW-tetO-ETV2）
（Cakir B, et al. Nat Methods. 2019 Nov;16(11):1169-1175.）
? ? ? ?vhCOs中的神經細胞不僅存活率要較control hCOs更高，而且具有功能的神經細胞數量也要比hCOs中更多。
? ? ? ?功能方面，通過跨內皮阻抗（TEER）分析表明，第30天及第70天時的vhCOs的TEER均顯著性高于hCOs，且其在三維結構上TEER阻值十分接近于人血腦屏障TEER阻值。
AAV介導跟蹤融合腦類器官的生成
? ? ? ?AAV1-CAG-tdTomato標記GE（神經節隆起）類器官，監測神經元遷移；AAV1-Syn-GCaMP6f-WPRE-SV40感染Cx（皮質）+GE類器官，激發鈣活性[Cx和GE類器官由H9 hESC或是Rett hiPSCs細胞系產生]。
? ? ? ?病毒載體：AAV（滴度1.98×1013 GC/mL，用量5μL）。
（Samarasinghe RA, et al. Nat Neurosci. 2021 Oct;24(10):1488-1500.）
病毒載體在眼類器官的應用
? ? ? ?AAV介導的淚腺類器官，治療干眼癥；有助于了解眼睛生理學和模擬眼科疾病。
（Manafi N, et al. Ocul Surf. 2021 Jan;19:1-15.）
病毒載體在乳腺類器官的應用
? ? ? ?利用慢病毒構建乳腺腫瘤類器官模型
? ? ? ?正常乳腺組織類器官中利用慢病毒轉導表達靶向P53/PTEN/RB1基因的sgRNA和Cas9酶，從而造成相應的基因敲除。
? ? ? ?病毒載體：慢病毒（滴度5×107 pfu/mL）
? ? ? ?P53/PTEN/RB1腫瘤抑制基因
? ? ? ?敲除P53/PTEN的正常乳腺組織類器官添加Nutlin-3a（10μM）處理7d將殺死所有表達野生型P53的細胞，并可用于選擇P53敲除的類器官。而類器官選擇和克隆培養，有助于優化小鼠原位類器官移植，無需手術即可移植類器官和雌激素顆粒，幫助治療乳腺癌。
（Dekkers JF, et al. Nat Protoc. 2021 Apr;16(4):1936-1965.）
? ? ? ?通過免疫組化檢測，與原始乳腺腫瘤標本比較發現，類器官在培養過程中有時失去ER(~25%標本，雌激素受體)、PR(~25%標本，孕酮受體)或HER2(~20%標本，人表皮生長因子受體2)表達，少數標本獲得ER(~10%)或HER2(<5%標本)表達。
病毒載體在腸道類器官的應用
LV轉導獲得HIE敲除細胞系
? ? ? ?人體腸道組織衍生的小腸（HIE，也稱為類器官）是用于胃腸道研究的強大的離體模型。使用CRISPR–Cas9來敲除影響HuNoV（人諾如病毒）感染的基因，包括宿主附著因子基因FUT2和先天免疫基因STAT1（信號轉導與轉錄激活因子1）。STAT1-KO HIE通過免疫印跡進行驗證，該免疫印跡減緩了STAT1蛋白的損失，頂端質膜蛋白（絨毛蛋白，Villin）仍在HIE中表達并被檢測為內部對照。
STAT1-KO HIE細胞更容易被GII.3（HuNoV毒株的一種）感染（Lin SC, et al. Nat Protoc. 2022 Apr;17(4):1004-1027.）
病毒載體在腸道類器官的應用
? ? ? ?病毒載體：AAV（rAAV2/5-CMV173-CFTRΔR和rAAV2/5-CMV173-eGFP-P2A-Fluc，用量：9×10^10 GC/每只，50μL）
利用LV構建人類CFTR缺陷類器官
（Vidovi? D, et al. Am J Respir Crit Care Med. 2016 Feb 1;193(3):288-98.）
? ? ? ?人類CFTR（囊性纖維化跨膜電導調節因子）缺陷類器官的rAAV-CFTRΔR轉導導致毛喉素誘導的腫脹，使CFTR功能恢復。在小鼠體內通過rAAV2/5介導的CFTRΔR轉導恢復了鼻粘膜中的離子轉運缺陷。
? ? ? ?類器官實驗很有價值，因為它們允許使用敏感和定量的腫脹測定對CF患者衍生材料進行功能性載體評估。
病毒載體在肺類器官的應用
? ? ? ?鑒定適用于肺芽類器官的AAV血清型
? ? ? ?病毒載體：AAV（rAAV-CMV/hCEFI-eGFP，3.5E+8~1.0E+9 GC）
（Meyer-Berg H, et al. Stem Cell Res Ther. 2020 Oct 23;11(1):448.）
病毒載體在肝類器官的應用
? ? ? ?選用適合肝類器官的AAV血清型
AAV-DJ載體高效轉導肝導管類器官
AAV-DJ載體介導的基因操作能夠剖析膽管細胞到肝細胞分化中的基因功能
? ? ? ?用AAV-DJ-HNF4α（肝細胞核因子4α）或AAV-DJ-GFP轉導肝導管類器官，然后進行肝細胞分化誘導。RNA測序顯示HNF4α過表達后，肝細胞標記基因Ttr、Cyp3a11（細胞色素P450/CYP450基因，在成熟肝細胞中特異表達）、Albumin（白蛋白）表達上調。表明AAV-DJ-HNF4α極大地促進了肝細胞成熟后的膽管細胞向肝細胞的分化。
（Wei J, et al. J Biol Chem. 2019 Sep 20;294(38):14096-14104.）
? ? ? ?在導管類器官中利用AAV-DJ載體轉導16種肝細胞富含轉錄因子，隨后進行肝細胞分化誘導。通過qRT-PCR檢測肝細胞marker（Alb、Cyp3a11、Sult1a1、Mup20和 Apoa1）及膽管細胞marker（Sox9和Spp1）表達水平。從而篩選確定了HOPX（同源域特有蛋白同源框）、TBX15（T-box 15）和TFCP2L1（轉錄因子CP2樣1）是肝細胞分化的主要調節因子。
? ? ? ?綜上所述，這種高效便捷的基因操作方法有助于研究肝譜系轉變中的基因功能以及工程類器官在再生醫學中的應用。
四.參考文獻
? ? ? ?[1]Heydari Z, et al. Organoids: a novel modality in disease modeling. Biodes Manuf.2021;4(4):689-716.
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? ? ? ?[3]Cakir B, et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nat Methods. 2019 Nov;16(11):1169-1175.
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? ? ? ?[5]Manafi N, et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 2021 Jan;19:1-15.
? ? ? ?[6]Dekkers JF, et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nat Protoc. 2021 Apr;16(4):1936-1965.
? ? ? ?[7]Lin SC, et al. Generation of CRISPR-Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue-derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning. Nat Protoc. 2022 Apr;17(4):1004-1027.
? ? ? ?[8]Vidovi? D, et al. rAAV-CFTRΔR Rescues the Cystic Fibrosis Phenotype in Human Intestinal Organoids and Cystic Fibrosis Mice. Am J Respir Crit Care Med. 2016 Feb 1;193(3):288-98.
? ? ? ?[9]Meyer-Berg H, et al. Identification of AAV serotypes for lung gene therapy in human embryonic stem cell-derived lung organoids. Stem Cell Res Ther. 2020 Oct 23;11(1):448.
? ? ? ?[10]Wei J, et al. Gene manipulation in liver ductal organoids by optimized recombinant adeno-associated virus vectors. J Biol Chem. 2019 Sep 20;294(38):14096-14104.
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