編者按：
? ? ? ?腺相關病毒（AAV）發(fā)展的最新進展產(chǎn)生了工程化衣殼，能夠比自然產(chǎn)生的衣殼更有效地轉導中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中定義明確的細胞群。AAV載體作為一個快速且靈活在體內(nèi)實現(xiàn)基因穩(wěn)定表達的手段，與目前的遺傳學調(diào)控技術相結合，能極大的推進神經(jīng)科學的變革。但是目前對于CNS病毒衣殼的研究主要集中在神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，對于特異性調(diào)節(jié)非神經(jīng)元細胞的病毒衣殼的研究仍進展緩慢。
? ? ? ?腦血管內(nèi)皮細胞是表達在血管腔隙的一類中樞非神經(jīng)元細胞群體，作為血腦屏障的重要組成部分，調(diào)節(jié)許多關鍵的生理過程。此外，內(nèi)皮細胞在神經(jīng)系統(tǒng)功能中起著至關重要的作用，越來越多的證據(jù)表明內(nèi)皮細胞損傷是導致各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要原因。毛細血管內(nèi)皮細胞能通過調(diào)節(jié)細胞物質(zhì)轉運維持血腦屏障的完整性，而靜脈內(nèi)皮細胞似乎在神經(jīng)免疫通訊中扮演重要角色。但是目前對于內(nèi)皮細胞有限的研究手段阻礙了對內(nèi)皮細胞功能進行具體而深入的研究。
? ? ? ?到目前為止，只有兩種病毒載體被認為能夠有效在腦血管內(nèi)皮細胞中表達，即AAV-PHP.V1和AAV-BR1，但是這兩類病毒都存在明顯的局限性。AAV-PHP.V1對感染的內(nèi)皮細胞沒有選擇性，并且對于星形膠質(zhì)細胞也有較高的趨向性。相比之下，AAV-BR1感染腦微血管內(nèi)皮細胞具有相對的特異性，但該載體在動脈和靜脈血管內(nèi)皮細胞的表達效率仍不清楚，并且最近研究發(fā)現(xiàn)，AAV-BR1在一些較大的血管節(jié)段的內(nèi)皮細胞表達效率很低。
? ? ? ?因此，小編在這里給大家推薦哈佛醫(yī)學院神經(jīng)生物學顧成華教授聯(lián)合美國麻省理工學院、哈佛大學博德研究所Benjamin E. Deverman教授發(fā)表于《nature cardiovascular research》的研究論文“A high-efficiency AAV for endothelial cell transduction throughout the central nervous system”。作者研發(fā)出一類AAV9工程化的病毒衣殼—AAV-BI30，這是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異而高效地轉導內(nèi)皮細胞的衣殼。在相對較低的全身劑量下，該載體可轉導成年C57BL/6小鼠大腦、視網(wǎng)膜和脊髓脈管系統(tǒng)中的大多數(shù)動脈、毛細血管和靜脈內(nèi)皮細胞。此外，研究人員還表明AAV-BI30在體內(nèi)對多種小鼠品系和大鼠內(nèi)皮細胞，在體外對人腦微血管內(nèi)皮細胞都有較強的轉導能力，可實現(xiàn)跨物種的特異性表達。最后，作者還證明了AAV-BI30在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中實現(xiàn)高效和內(nèi)皮特異性Cre介導的基因操縱的能力。這使得AAV-BI30非常適合解決神經(jīng)血管生物學中突出的研究問題，有利于加深對正常生理中神經(jīng)血管相互作用的認識，以及開發(fā)相關中樞疾病中治療內(nèi)皮功能障礙的藥物。
一、AAV-BI30在小鼠和大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞中有效表達
? ? ? ?為了開發(fā)出具有高效感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)皮細胞能力的病毒衣殼，研究人員構建出一個AAV9衣殼文庫，希望能從中篩選出有效地感染人和小鼠內(nèi)皮細胞的病毒衣殼。該文庫構建基于重組AAV的骨架AAV9-CMV-Express進行篩選，在感染的細胞中表達病毒衣殼基因，通過對病毒衣殼的mRNA進行測序，篩選出不同類型的病毒衣殼。通過兩輪篩選，發(fā)現(xiàn)AAV-BI30在各物種的腦微血管內(nèi)皮細胞中具有較高的感染效率，并且在較低病毒劑量（1×1011 vg/每只）的情況下實現(xiàn)了在小鼠和大鼠的腦微血管內(nèi)皮細胞的有效表達。
? ? ? ?但是AAV-BI30對于肝細胞有較高的趨向性，并且導致肝細胞的形態(tài)異常。為了降低AAV-BI30對肝細胞的損傷，研究人員在病毒中加入肝特異性的miR-122重復序列，該載體在降低病毒肝臟趨向性的同時，保留了腦微血管內(nèi)皮細胞的特異性表達。
? ? ? ?為了研究AAV-BI30在腦微血管內(nèi)皮細胞中的感染效率，研究人員設計了一種特殊的分析方案，即通過病毒的NLS-GFP和內(nèi)皮特異性轉錄因子ERG的共定位來評估AAV-BI30的感染效率，該方案能快速識別出腦血管的單個內(nèi)皮細胞。通過與AAV-BR1的對比，發(fā)現(xiàn)兩類病毒均有明顯的腦微血管內(nèi)皮細胞的趨向性，但是AAV-BI30在微血管內(nèi)皮細胞的感染效率明顯優(yōu)于AAV-BR1。
圖1. AAV-BI30在小鼠和大鼠腦血管內(nèi)皮細胞中有效表達
二、AAV-BI30在動脈和靜脈血管內(nèi)皮細胞中有效表達
? ? ? ?接著研究人員關注AAV-BI30在動脈和靜脈血管內(nèi)皮細胞的表達效率，通過腦血管的冠狀切面或者矢狀切面可以評估AAV在毛細血管的感染效率，但該方案評估動靜脈毛細血管的表達效率存在明顯的局限性，因為動脈和靜脈不成比例的分布導致局部切面獲取的信息很有限，因此研究人員制備了完整的腦血管系統(tǒng)形態(tài)標記。發(fā)現(xiàn)AAV-BI30在62%的動脈血管內(nèi)皮細胞和71%的靜脈血管內(nèi)皮細胞有效表達，而作為對照的AAV-BR1僅在23%的動脈血管內(nèi)皮細胞和35%的靜脈血管內(nèi)皮細胞中表達。
? ? ? ?為了進一步確認AAV-BI30在活體組織中的表達水平，研究人員使用在體雙光子技術對AAV-BI30的表達效果進行進一步確認。研究發(fā)現(xiàn)AAV-BI30（劑量為1×1011 vg/每只）在活體小鼠的動脈血管、靜脈血管和微小毛細血管內(nèi)皮細胞中均穩(wěn)定表達。因此，AAV-BI30在較低病毒劑量的情況下，就能實現(xiàn)腦血管內(nèi)皮細胞的高效特異性表達。
圖2. AAV-BI30在動脈和靜脈血管內(nèi)皮細胞中有效表達
三、AAV-BI30在視網(wǎng)膜和脊髓的內(nèi)皮細胞中有效表達
? ? ? ?目前對于中樞內(nèi)皮細胞的研究大多集中在腦血管系統(tǒng)，但是視網(wǎng)膜和脊髓的血管系統(tǒng)對于血管生成、血腦屏障動力學特征以及神經(jīng)血管病變中均具有重要作用，因此研究人員關注AAV-BI30對視網(wǎng)膜和脊髓血管系統(tǒng)內(nèi)皮細胞的標記效率。
? ? ? ?經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)AAV-BI30在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞的感染效率顯著優(yōu)于AAV-BR1：AAV-BI30感染了73%的淺叢動脈內(nèi)皮細胞、81%的淺叢靜脈內(nèi)皮細胞、69%的中間叢內(nèi)皮細胞和75%的深叢內(nèi)皮細胞。而AAV-BR1只感染14%的淺叢動脈內(nèi)皮細胞、23%的淺叢靜脈內(nèi)皮細胞、18%的中間叢內(nèi)皮細胞和30%的深叢內(nèi)皮細胞。
? ? ? ?在脊髓血管內(nèi)皮細胞中也發(fā)現(xiàn)AAV-BI30的感染效率顯著高于AAV-BR1，AAV-BI30可以感染76%的脊髓血管內(nèi)皮細胞，而AAV-BR1只能感染46%的脊髓血管內(nèi)皮細胞。因此AAV-BI30內(nèi)皮細胞的特異性表達不僅僅局限于腦血管內(nèi)皮細胞，并且在全腦內(nèi)皮細胞中均能有效表達。
圖3. AAV-BI30在視網(wǎng)膜和脊髓的內(nèi)皮細胞中有效表達
四、使用AAV-BI30對腦血管內(nèi)皮細胞進行基因操縱
? ? ? ?為了評估AAV-BI30對腦血管內(nèi)皮細胞的基因操縱能力，研究人員使用Cre重組酶系統(tǒng)對病毒進行包裝（AAV-BI30：CAG-CRE-miR122-WPRE），并在Rosa26 Cre依賴的報告小鼠進行研究。發(fā)現(xiàn)病毒能驅動94%的內(nèi)皮細胞發(fā)生基因重組。
? ? ? ?使用AAV-BI30對腦血管內(nèi)皮細胞進行功能研究，Caveolin-1（Cav1，小窩蛋白）在維持神經(jīng)血管耦合、維持血腦屏障中具有重要作用。在Cav1-loxp小鼠使用AAV-BI30的cre病毒進行重組，發(fā)現(xiàn)AAV-BI30能顯著降低血管內(nèi)皮細胞的Cav1的表達，但不會影響非血管內(nèi)皮細胞的Cav1的表達。
? ? ? ?以上結果說明AAV-BI30在腦血管內(nèi)皮細胞的功能研究中具有重要的作用，在缺乏中樞內(nèi)皮細胞標記的特異性轉基因小鼠的研究現(xiàn)狀面前，AAV-BI30有望成為特異性研究中樞內(nèi)皮細胞功能的特異性干預手段。
圖4. AAV-BI30可對腦血管內(nèi)皮細胞進行基因操縱
五、總結
? ? ? ?綜上所述，本文研究人員通過構建AAV衣殼文庫，篩選獲得AAV-BI30，并且經(jīng)過與目前唯二的腦血管標記病毒AAV-PHP.V1和AAV-BR1的對比，發(fā)現(xiàn)該病毒在更低的病毒劑量（1×1011vg/每只）條件下，能高效的在中樞不同類型血管內(nèi)皮細胞中特異性表達，展現(xiàn)出了AAV-BI30在特異性研究腦血管內(nèi)皮細胞功能的巨大潛力，有利于加深我們對腦血管內(nèi)皮細胞生理功能的認識，有利于揭示腦血管內(nèi)皮細胞在神經(jīng)病理狀態(tài)的變化，為研究人員早日攻克腦血管功能障礙相關的神經(jīng)和精神疾病提供重要保障。
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