細胞活性檢測除了CCK8和MTT外還有一個XTT檢測方法哦!
細胞活性檢測XTT法是一種檢測細胞增殖和活性的方法。其檢測原理是:XTT是一種與MTT類似的四唑氮衍生物,可被活細胞線粒體脫氫酶還原成水溶性的棕色甲肷產物。當XTT與電子耦合共同使用時,甲肷的生成量與細胞的增殖程度呈正相關。
在細胞活性檢測實驗中,將XTT試劑和電子偶聯試劑按一定比例混合后,加入到待測細胞中,然后進行孵育。在孵育過程中,活細胞會將XTT試劑還原成甲肷產物,而死細胞則無法進行這種還原反應。通過檢測甲肷產物的生成量,可以判斷細胞的增殖程度和細胞活力。
使用XTT法進行細胞活性檢測具有操作簡便、靈敏度高、重復性好等優點。同時,該方法對細胞毒性低,適用于各類哺乳動物細胞活性的檢測。
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試劑與材料:
(1) XTT:用60℃預熱培養液配制成6.6mmol/L,過濾除菌,現配現用;?
(2) 吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS):用PBS配制成220mmol/L,4℃避光保存20天;?
(3) XTT/PMS:XTT與PMS按1:1混合(臨用時混合)。
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XTT法操作步驟:
(1)刺激增殖反應,按照一定比例將XTT試劑與電子耦合試劑混合,加入到細胞培養液中,繼續培養一定時間;
(2) 于終止培養前2h,每孔加入XTT/PMS 20μl,混勻后再培養2h;?
(3) 在酶標儀上450nm處測定光吸光度,參考波長為655nm。?
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【結果分析】?
計算SI:SI=試驗孔OD均值/對照孔OD均值?
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XTT法操作注意事項:
(1)絲裂原的質量和活性是測定淋巴細胞增殖反應的關鍵因素。不同廠家的產品,質量、活性不同,其使用的最佳刺激量也不同,因而在實驗前,應事先確定其最佳刺激量。?
(2) 檢測T細胞增殖反應,絲裂原用PHA或ConA;B細胞增殖反應用LPS或SPA;T、B細胞增殖反應則用PWM。?
(3) 增殖反應的細胞應保持高活性,一般應≥95%。應用單抗分離制備的反應細胞因保存劑(如NaN3)或抗體的直接作用可抑制細胞的增殖。此外,增殖細胞的濃度過高或過低均不利于細胞生長。?
(4) 細胞培養液應無菌、無支原體污染,特別是小牛血清應加熱滅活補體,避免LPS或其他能促進細胞增殖物的污染。因此,實驗前應選擇本底低的小牛血清。用人"AB"型血清或自體血清也應加熱滅活補體。
