癲癇是一種常見的中樞神經系統疾病，臨床癥狀表現為反復不自主發作并伴隨焦慮、抑郁及認知障礙等并發癥，嚴重困擾患者的生活工作，給家庭和社會帶來沉重的負擔。顳葉癲癇是最常見的耐藥癲癇類型之一，灶點大多起源于邊緣區域，尤其海馬最為常見。目前臨床上用于治療顳葉癲癇的方法主要包括藥物治療、深部腦電刺激和手術切除，但這些方法往往缺乏相容性，最終導致藥物耐受、術后復發以及其他有害的副作用。顳葉癲癇發病機制非常復雜，越來越多的研究表明癲癇的形成是一種環路水平的病理變化，由于環路過度興奮導致高度同步化的癲癇發作活動。近年來伴隨光遺傳學和化學遺傳學的技術手段出現，它們為特異性實時調控特定神經元及其特定環路提供了可能，因此發現和解析腦內癲癇相關神經環路并進一步進行干預和調控是目前顳葉癲癇發病機制研究的熱點。

近日神經精神領域的著名雜志《Biological Psychiatry》雜志在線發表了浙江大學藥學院陳忠教授課題組題為“Direct septum-hippocampal cholinergic circuit attenuates seizure through driving somatostatin inhibition”的研究成果。目前，大部分癲癇相關研究主要關注于癲癇灶點內部興奮性谷氨酸能神經元和抑制性GABA能神經元之間的平衡關系在顳葉癲癇發病機制中的作用，而該研究則首次揭示了內側隔核中的膽堿能神經是通過直接投射到海馬并激活其抑制性SST亞型的GABA能神經元從而發揮顯著的抗癲癇作用，首次闡明了膽堿能神經環路在顳葉癲癇中的作用機制。

1. 癲癇發作過程中，內側隔核膽堿能神經元活動被抑制

首先，研究人員通過鈣信號記錄系統發現，當在小鼠海馬給予電刺激誘發癲癇發作時，內側隔核的膽堿能神經元群體的鈣信號明顯下降，由于鈣信號反應神經元活動性，因此該結果表明內側隔核膽堿能神經元活動一定程度上被抑制。進一步為更精準的明確內側隔核膽堿能神經元的活動變化，研究人員引入了在體單細胞記錄去記錄單個神經元的活動，結果同樣發現內側隔核膽堿能神經元活動被抑制，與鈣信號記錄一致。

圖1. 癲癇發作時，內側隔核膽堿能神經元的神經活動受到抑制

2. 特異性激活內側隔核膽堿能神經元抑制顳葉癲癇發作

為進一步明確內側隔核膽堿能神經元在顳葉癲癇中的作用，研究人員在小鼠海馬電點燃模型中使用光遺傳學特異性激活內側隔核膽堿能神經元能夠明顯抑制癲癇形成過程，表現為抑制癲癇發作等級的發展進程，縮短后放電時長。另外由于海人藻酸誘發的慢性自發模型更能模擬臨床顳葉癲癇病人的病理特征，因此研究人員進一步在該模型中用化學遺傳學方法特異性激活內側隔核膽堿能神經元，同樣能夠明顯抑制癲癇自發發作，表現為減少自發發作次數和縮短自發發作總時長。根據以上結果研究人員明確特異性激活內側隔核膽堿能神經元能夠抑制顳葉癲癇發作。

圖2. 選擇性激活內側隔核膽堿能神經元可抑制顳葉癲癇發作

3. 特異性抑制內側隔核膽堿能神經元促進顳葉癲癇發作

在明確內側隔核膽堿能神經元在抗癲癇作用中的充分性后，研究人員想進一步探究其內源性活動對于調控癲癇發作是否是必要的。研究人員在小鼠海馬電點燃模型中引用了兩種病毒，一種是光遺傳學病毒，還有一種是借助AAV載體，將caspase3特異性轉染到內側隔核膽堿能神經元，結果發現提前抑制或用病毒特異性殺死內側隔核膽堿能神經元均能促進癲癇發作，表現為加快癲癇發作等級的發展進程和延長后放電時長。由此研究人員推斷內側隔核膽堿能神經元在抑制癲癇發作過程中具有充分必要性。

圖3. 選擇性抑制內側隔核膽堿能神經元促進顳葉癲癇發作

4. 內側隔核投射到海馬的直接膽堿能通路介導抗癲癇作用

研究人員進一步探索內側隔核膽堿能神經元的抗癲癇環路機制。由于內側隔核膽堿能神經元既可以直接投射到海馬，也可以先投射到內側隔核局部其他類型神經元再由其他類型神經元投射到海馬發揮作用。研究人員首先直接光照激活內側隔核膽堿能神經元投射到海馬的纖維末梢，結果發現能夠發揮抗癲癇作用，且該作用可以被提前注射到海馬局部的膽堿能M/N受體混合拮抗劑逆轉。之后將混合拮抗劑提前注射到內側隔核，則發現并不能逆轉激活內側隔核膽堿能神經元產生的抗癲癇作用。以上實驗表明內側隔核膽堿能神經元的抗癲癇作用是通過直接投射到海馬所介導，且依賴于M和N型膽堿能受體，但與間接投射環路無關。

圖4. 內側隔核投射到海馬的直接膽堿能通路介導抗癲癇作用

5. 海馬GABA能神經元介導內側隔核膽堿能神經環路的抗癲癇作用

為了深入探究直接環路如何調控海馬神經元興奮性，研究人員利用逆向跨單突觸追蹤實驗結合在體神經元記錄和離體腦片電生理實驗表明內側隔核膽堿能神經元在結構上主要靶向海馬GABA能神經元，且光遺傳學激活內側隔核膽堿能神經元可以直接激活海馬的GABA能神經元。同時行為學上化學遺傳學抑制海馬GABA能神經元能夠逆轉光遺傳學激活內側隔核投射到海馬的膽堿能纖維末梢的抗癲癇作用。因此，以上結果表明，內側隔核膽堿能神經元主要通過直接投射到海馬并激活海馬的GABA能神經元發揮抗癲癇作用。

圖5. 海馬GABA能神經元介導內側隔核膽堿能神經環路的抗癲癇作用

6. 海馬SST亞型的GABA能神經元是內側隔核膽堿能神經環路抗癲癇作用的關鍵下游效應神經元

由于GABA能神經元具有多樣性，研究人員進一步探究不同亞型GABA能神經元的作用。研究人員通過結合光遺傳學和化學遺傳學方法發現，特異性抑制海馬的GABA能神經元亞型生長激素抑制素（somatostatin, SST）神經元能夠逆轉內側隔核膽堿能神經元的抗癲癇作用，而另一種GABA能神經元亞型小清白蛋白（parvalbumin, PV）神經元則不參與介導該抗癲癇環路。

圖6. 海馬SST亞型的GABA能神經元參與內側隔核膽堿能神經環路的抗癲癇作用

總結：

在此項研究中，團隊使用了多種樞密科技的工具病毒，AAV-VGAT1-CRE，AAV-PV-Cre 和 AAV-SST-Cre 病毒用于特異性操控海馬的GABA能神經元；AAV-EF1a-DIO-EGFP-TVA，AAV-DIO-RG 和RV-EnvA-ΔG-DsRed 用于逆向跨單突觸追蹤從中隔膽堿能神經元投射到海馬不同亞型GABA能神經元的直接投射。研究首次揭示了內側隔核中的膽堿能神經是通過直接投射到海馬并激活其抑制性SST亞型的GABA能神經元從而發揮顯著的抗癲癇作用。該環路的發現加深了對癲癇異常網絡形成的認識，并為臨床顳葉癲癇的精準藥物治療靶點研究提供了重要的實驗依據。

原文鏈接：

https://www.biologicalpsychiatryjournal.com/article/S0006-3223(19)31883-9/fulltext