在生物制藥層析工藝中，非特異性吸附（Non-specific Binding, NSB）常被視為難以捉摸的工藝干擾。非特異性吸附是目標蛋白與填料非預期位點的結(jié)合、非目標蛋白與填料的非預期結(jié)合的統(tǒng)稱，二者均會引發(fā)工藝問題。其典型表現(xiàn)有：目標蛋白收率異常下降、洗脫峰拖尾、雜質(zhì)清除率波動等。要真正解決非特異性吸附，必須跳出簡單的表面現(xiàn)象，深入到分子熱力學與填料-蛋白質(zhì)界面動力學的層面。
分子熱力學分析
傳統(tǒng)觀點認為，非特異性吸附是蛋白質(zhì)分子與填料的“錯誤”結(jié)合。這種觀點也不為錯，因為這確實是非特異性結(jié)合的結(jié)果，也是我們在工作討論中所用的行話。
但如果從更深層的物理化學視角看，在蛋白質(zhì)樣品流經(jīng)層析柱時，樣品溶液中一個個到處自由擴散的蛋白質(zhì)，并沒有長眼睛，根本不會“認識”所處的周圍的填料是親和型的，還是離子型的，抑或是多模式型的，更不會據(jù)此提前做好準備去結(jié)合填料。填料的這些分類，只是我們基于使用方便、結(jié)合一定的科學性給予的定義，樣品中的蛋白質(zhì)并不會提前知道我們用什么樣的填料去吸附他們。那么，在本質(zhì)上，蛋白質(zhì)是怎么吸附到填料上的呢？
分子熱力學告訴我們，特異性吸附本質(zhì)上是目標蛋白質(zhì)與填料特異性位點結(jié)合時，吉布斯自由能（ΔG）下降的體現(xiàn)。而同理，非特異性吸附的熱力學本質(zhì)為非目標蛋白與填料任意位點、目標蛋白與填料非預期位點結(jié)合時，吉布斯自由能（ΔG）下降的體現(xiàn)，二者均是體系自發(fā)的熱力學過程。
另外，填料多位點吸附也會增加非特異性吸附的可能。如果在工藝上使用了較長的保留時間，蛋白分子表面可能會與某些填料形成多個位點的吸附。一旦蛋白質(zhì)被填料上的多個吸附位點結(jié)合，那蛋白質(zhì)的解離速率常數(shù)將會大幅下降。目標蛋白質(zhì)在純化層析圖譜上表現(xiàn)為洗脫峰嚴重拖尾，或者根本無法被正常洗脫，導致洗脫體積增加或者收率下降（Lenhoff, 2011）；而非目的蛋白質(zhì)的非特異性吸附增強，則會導致填料清洗困難，填料使用壽命縮短。
填料-蛋白質(zhì)界面動力學分析
在更為宏觀的層面上，非特異性吸附應(yīng)視為蛋白質(zhì)狀態(tài)、填料-蛋白質(zhì)界面、 溶液三者相互作用的結(jié)果。
? 蛋白質(zhì)狀態(tài)：表面電荷異質(zhì)性與構(gòu)象變化
• 蛋白質(zhì)的等電點（pI）僅為宏觀平均值。即使在 pI 以上，蛋白質(zhì)局部強正電荷區(qū)域仍可與陰離子交換填料發(fā)生非預期的結(jié)合，也即非特異性吸附。
• 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性需要合適的溶液條件，而當?shù)鞍踪|(zhì)所處的溶液體系逼近穩(wěn)定邊界時，蛋白質(zhì)的局部結(jié)構(gòu)會變得松弛，暴露出內(nèi)部疏水區(qū)域，在純化時會顯著增強非特異性吸附（Hallgren et al., 2000; Lenhoff, 2011）。
? 填料-蛋白質(zhì)界面
不同填料基質(zhì)在非特異性吸附方面的表現(xiàn)存在顯著差異。
• 瓊脂糖基質(zhì)填料因具有天然多糖結(jié)構(gòu)，其表面具備高度親水性，使得基質(zhì)本身對蛋白質(zhì)分子的吸附能力極弱；同時，它在較寬的pH值和離子強度范圍內(nèi)，仍能穩(wěn)定保持極低的非特異性吸附性能。正是這些特性，讓瓊脂糖基質(zhì)通常表現(xiàn)出極低的非特異性吸附，也使其成為蛋白質(zhì)純化（尤其是單克隆抗體等大分子純化）中最常用的基質(zhì)之一。
• 而聚合物基質(zhì)的填料，為了增加填料表面的親水性，常常會在其表面做一些親水性的修飾，而這些親水修飾并非絕對安全。首先，親水修飾可能不完全，導致填料上會殘余一些官能團，這可能引起非特異性吸附；其次，表面親水修飾看似解決了非特異性型吸附，卻有可能使得填料局部的配基密度過高，從而造成非特異性吸附的增強。另外，部分聚合物基質(zhì)孔徑較小，蛋白質(zhì)在填料孔內(nèi)的傳質(zhì)受到空間位阻的影響，孔內(nèi)的蛋白質(zhì)濃度遠高于樣品中的濃度，蛋白質(zhì)相當于被富集，這又會放大非特異性吸附作用（Müller, 1990; Lenhoff, 2011）。
? 溶液：離子效應(yīng)
• 樣品中的鹽離子對蛋白質(zhì)和填料的吸附作用遵循霍夫邁斯特序列（Hofmeister Series），有些類型的鹽離子破壞水結(jié)構(gòu)，另一些類型的鹽離子增強疏水相互作用，從而改變蛋白-填料界面結(jié)合強度。
有效減少NSB的措施
關(guān)于減少蛋白質(zhì)的非特異性吸附，目前已經(jīng)有很多的研究。我們在日常的純化過程，可以使用的措施有：
• 在緩沖液中加入合適的添加劑，如精氨酸、脯氨酸或0.1~0.5%非離子表面活性劑，提高蛋白質(zhì)非特異性吸附發(fā)生的熱力學閾值，防止非特異性吸附的發(fā)生。
• 在離子交換層析中，使用更高強度的緩沖液（如50mM代替20mM），防止填料表面處的pH波動誘導蛋白分子構(gòu)象改變。
• 分步洗脫策略：如果是非目標蛋白的非特異性吸附，我們可以利用非特性型吸附組分與目標蛋白在解吸附動力學上的差異，通過調(diào)節(jié)pH和或鹽梯度控制，進行分步洗脫提高純度。
• 優(yōu)化保留時間：在保證收率的前提下盡量縮短保留時間，防止非特異性結(jié)合變強。
結(jié)語
非特異性吸附在蛋白質(zhì)純化中并不罕見，我們在純化過程中，可以對填料、溶液、添加劑等進行篩選，減少蛋白質(zhì)非特異性吸附的發(fā)生，以減輕其對純度、收率等關(guān)鍵質(zhì)量屬性和工藝性能的影響。
參考文獻
[1] Norde, W. (1996). Driving forces for protein adsorption at solid surfaces. Macromolecular Symposia, 103, 5-18.
[2] Haynes, C.A. & Norde, W. (1994). Globular proteins at solid/liquid interfaces. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2, 517-566.
[3] Hallgren, E. et al. (2000). Protein retention in ion-exchange chromatography: effect of net charge and charge distribution. Journal of Chromatography A, 877(1-2), 13-24.
[4] Lenhoff, A.M. (2011). Protein adsorption and transport in polymer-functionalized ion-exchangers. Journal of Chromatography A, 1218(49), 8748-8759.
[5] Müller, W. (1990). New ion exchangers for the chromatography of biopolymers. Journal of Chromatography A, 510, 133-140.