癌癥患者90%以上的死亡率與耐藥性有關？耐藥性的持續存在仍然是該領域的一大挑戰,這也是癌癥死亡率高的原因？腫瘤細胞的耐藥怎么樣？ 怎么構建腫瘤細胞的耐藥？以下幾種方法輕松搞定耐藥株的構建：

腫瘤耐藥株的構建方法主要有以下幾種：

一、藥物濃度遞增法

藥物濃度遞增法是指最初使用低濃度的藥物刺激細胞，等待細胞適應低濃度的環境之后，再略微提高藥物濃度，繼續等待細胞適應，經過反復的培養和加壓，最終使細胞可以在高濃度的藥物環境下生存。

二、大劑量藥物沖擊法

大劑量藥物沖擊法是在細胞培養時加入超高濃度的藥物，但孵育時間很短，一般僅有幾分鐘，然后將細胞轉移至不含藥物的培養液中慢慢恢復，通過重復以上步驟最終篩選出高倍數的耐藥細胞株。

三、藥物濃度遞增與大劑量藥物沖擊相結合法

這種方法結合了上述兩種方法的優點，既通過藥物濃度遞增使細胞逐漸適應高濃度藥物環境，又通過大劑量藥物沖擊模擬臨床上的化療方式，以篩選出更具穩定性和耐藥性的細胞株。但這種方法相對復雜，操作難度較高。

四、轉基因結合藥物篩選法

轉基因結合藥物篩選法是通過基因工程技術將耐藥相關基因導入細胞，然后通過藥物篩選獲得耐藥細胞株。

開始構建腫瘤細胞的耐藥株啦

一、選取狀態良好的腫瘤細胞作為親本細胞，進行擴增培養。

二、通過MTT或者CCK8實驗，確定親本細胞對目標藥物的初始敏感性，即IC50（半數抑制濃度）值。

耐藥株IC50的計算可以采用以下兩種方法：

1. 改良寇式法：lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)。其中，Xm為lg最大劑量，I為lg(最大劑量/相臨劑量)，P為陽性反應率之和，Pm為最大陽性反應率，Pn為最小陽性反應率。

也可以通過實驗測定不同濃度藥物對耐藥株的生長抑制率，然后繪制生長抑制率與藥物濃度的關系曲線，通過曲線找到抑制率為50%時對應的藥物濃度，即為IC50。耐藥指數（RI）也是一個相關指標，可以通過耐藥組IC50與親代細胞IC50的比值來計算，即RI=耐藥組IC50/親代細胞IC50。

需要注意的是：IC50的計算可能受到多種因素的影響，如實驗條件、細胞狀態、藥物純度等，因此在實際操作中需要嚴格控制實驗條件，確保數據的準確性和可靠性。

三、條條大路通羅馬，幾條路走下來發現這種方法構建穩轉的耐藥株最快，而且穩

1. 使用最低有效劑量的藥物持續刺激親本腫瘤細胞一段時間（如48小時），讓細胞適應這一藥物環境。

2. 然后，更換不含藥物的培養基繼續培養傳1-2代（以細胞生長倍增正常為準），傳代待細胞生長至80%左右，再次使用高于細胞耐受的濃度的藥物培養5-10分鐘后換液，去除死細胞，PBS清洗兩次，加含有2X最低劑量的培養基培養至細胞長滿，傳代；之后每次傳代后在細胞長到80%以上的密度用高濃度藥物培養基沖擊一次，再換上比之前代次高一倍的培養基培養直到耐藥指數達到細胞耐藥的頂峰。

四、耐藥細胞株的篩選與驗證

在高濃度藥物誘導下，篩選出生長狀態良好的細胞，進一步擴增培養。

通過耐藥倍數檢測、耐藥相關蛋白檢測等方法，驗證耐藥細胞株的耐藥性；驗證方法參考步驟二。

五、耐藥細胞株的穩定與維持

將篩選出的耐藥細胞株脫藥培養3代后開始凍存，以確保其穩定性。

定期檢查細胞的生長情況和耐藥性，如有必要，可進一步進行篩選和優化。

                                                      T24/DDP 人膀胱癌耐藥細胞

                                               檢測的實驗結果

六、需要注意的小細節

1. 在整個過程中，需確保實驗操作的無菌性，避免細胞污染。

2. 藥物濃度的刺激和遞增應循序漸進，避免細胞因藥物濃度過高而死亡。

3. 耐藥細胞株的構建和培養都可能需要長時間和大量的努力，而且不同的細胞對耐藥的展現的形態也不一樣，比如T24/DDP此細胞耐藥值在1ug/ml，但是在藥物加到800ng/ml的時候細胞就會和藥物發生抵抗：它會長觸角并且伴有分泌物產生，當藥物加到1ug/ml的時候耐藥細胞會比正常細胞生長周期緩2-3天左右；和抗揍的HepG2相比，它的耐藥是很多腫瘤細胞都望塵莫及的，它的IC50值可達23.35 μg/mL，藥物濃度越高，細胞發生的簇集反應越大以對抗藥物。