在做任何事情前，我們總會(huì)去考慮成本 ，一旦成本高于成果或者付出太大的時(shí)候，都不由自主的想要控制 科研實(shí)驗(yàn)也是一樣 ，當(dāng)成本大于成果時(shí)候，即使再好的技術(shù)，也依然受不到科研市場(chǎng)的認(rèn)可，因此，越來(lái)越多的老師傾向于給珍貴的細(xì)胞做永生化，上期我們說(shuō)了BBB實(shí)驗(yàn)的操作protocol，這期我們來(lái)講講最簡(jiǎn)單的細(xì)胞永生化，無(wú)論在良性非永久傳代的腫瘤原代細(xì)胞，還是正常的組織提取的細(xì)胞它一樣受用，除了預(yù)實(shí)驗(yàn)以外，它無(wú)處不在。
永生化（英語(yǔ)：Immortalized cells）是指細(xì)胞取得可突破海弗里克極限、進(jìn)行無(wú)限制分裂的過(guò)程，永生化一般是端粒酶活化的結(jié)果。在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，永生化是正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞的標(biāo)志之一。另外，在科學(xué)研究中，有時(shí)為了研究方便，會(huì)人為誘導(dǎo)細(xì)胞永生化。
人為誘導(dǎo)細(xì)胞永生化的方法可分為物理誘導(dǎo)、化學(xué)誘導(dǎo)，以及生物學(xué)方法誘導(dǎo)三種。物理誘導(dǎo)即通過(guò)放射線照射、化學(xué)誘導(dǎo)是指通過(guò)致癌劑處理的方法誘導(dǎo)細(xì)胞永生化，而生物學(xué)誘導(dǎo)包括病毒感染（如SV40病毒、人乳頭瘤病毒）、轉(zhuǎn)入SV40病毒SV40大T抗原等方式。
永生化細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)：
1.與正常細(xì)胞相比，永生化細(xì)胞系可在體外長(zhǎng)期傳代，至少在50代以上。
2.具有相對(duì)穩(wěn)定的，與正常細(xì)胞接近的生物學(xué)性狀。無(wú)致瘤性,是藥物篩選，實(shí)驗(yàn)建模，基因研究的首選。
細(xì)胞永生化的步驟來(lái)啦，以皮膚成纖維細(xì)胞永生化，6孔板鋪板為例哦 ：
1. 將原代細(xì)胞傳至穩(wěn)定的擴(kuò)增代次，比如內(nèi)皮細(xì)胞可以在第6代左右進(jìn)行構(gòu)建 ，成纖維細(xì)胞傳代比內(nèi)皮要多，所以為了節(jié)約細(xì)胞我們會(huì)在細(xì)胞的第8-10代進(jìn)行永生化感染，而神經(jīng)元細(xì)胞需要在分離提取后就加入猿猴病毒40大T抗原LT或者人端粒酶催化亞單位hTERT病毒。
2. 將要感染的細(xì)胞接種到六孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為2×10^5cells，次日進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
3. 轉(zhuǎn)染前將培養(yǎng)液換為FGM低血清成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基。取50μl FGM成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基，分組加入0.5-0.8μg含有LT cDNA的質(zhì)粒psv3-neo和含有hTERT cDNA的質(zhì)粒pCl-Neo-hTERT。
4. 再吸取50μl的FGM成纖維培養(yǎng)基，加入1-2ul脂質(zhì)體。
5. 分別室溫孵育5分鐘后.將兩者混合，混合后在孵育10-20分鐘（孵育過(guò)程中可用移液槍輕輕吹打，使其完全融合）
6. 孵育完成后，加入FGM成纖維培養(yǎng)基 ，擴(kuò)溶至1ml左右，沿孔壁加入需要感染的細(xì)胞中
7. 將轉(zhuǎn)染細(xì)胞放入37℃ CO2孵箱中培養(yǎng)。
8. 轉(zhuǎn)染后6-10小時(shí)換為不含病毒的培養(yǎng)液，細(xì)胞接近匯合時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行1：5傳代，
9. 繼續(xù)培養(yǎng).待密度接近50％～70％時(shí)，加400ug/mL的G418進(jìn)行篩選.
10. 待出現(xiàn)抗性克隆，濾紙法分離細(xì)胞克隆，重新接種培養(yǎng)；
永生化是否成功，做下以下檢測(cè)就可以了：
(1)將細(xì)胞和未感染的原代細(xì)胞進(jìn)行傳代 ，發(fā)現(xiàn)未感染的細(xì)胞在經(jīng)歷的代次中逐漸衰老
(2)核型分析:取轉(zhuǎn)染并篩選后的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，進(jìn)行核型分析檢測(cè);
(3)取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞注入到裸鼠皮下，進(jìn)行致瘤性檢測(cè):
(4)免疫熒光檢測(cè)。檢測(cè)沒(méi)有問(wèn)題，恭喜您，永生化成功了， 它就是你的寶寶了 ，你可以給它取個(gè)好聽(tīng)的名字或者代號(hào)，也可以用它實(shí)現(xiàn)你的科學(xué)理想啦。
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