在做任何事情前，我們總會去考慮成本 ，一旦成本高于成果或者付出太大的時候，都不由自主的想要控制 科研實驗也是一樣 ，當成本大于成果時候，即使再好的技術，也依然受不到科研市場的認可，因此，越來越多的老師傾向于給珍貴的細胞做永生化，上期我們說了BBB實驗的操作protocol，這期我們來講講最簡單的細胞永生化，無論在良性非永久傳代的腫瘤原代細胞，還是正常的組織提取的細胞它一樣受用，除了預實驗以外，它無處不在。

永生化（英語：Immortalized cells）是指細胞取得可突破海弗里克極限、進行無限制分裂的過程，永生化一般是端粒酶活化的結果。在腫瘤發生過程中，永生化是正常細胞轉變為癌細胞的標志之一。另外，在科學研究中，有時為了研究方便，會人為誘導細胞永生化。

人為誘導細胞永生化的方法可分為物理誘導、化學誘導，以及生物學方法誘導三種。物理誘導即通過放射線照射、化學誘導是指通過致癌劑處理的方法誘導細胞永生化，而生物學誘導包括病毒感染（如SV40病毒、人乳頭瘤病毒）、轉入SV40病毒SV40大T抗原等方式。

永生化細胞的優勢：
1.與正常細胞相比，永生化細胞系可在體外長期傳代，至少在50代以上。
2.具有相對穩定的，與正常細胞接近的生物學性狀。無致瘤性,是藥物篩選，實驗建模，基因研究的首選。

細胞永生化的步驟來啦，以皮膚成纖維細胞永生化，6孔板鋪板為例哦 ：
1. 將原代細胞傳至穩定的擴增代次，比如內皮細胞可以在第6代左右進行構建 ，成纖維細胞傳代比內皮要多，所以為了節約細胞我們會在細胞的第8-10代進行永生化感染，而神經元細胞需要在分離提取后就加入猿猴病毒40大T抗原LT或者人端粒酶催化亞單位hTERT病毒。
2. 將要感染的細胞接種到六孔板，每孔細胞數為2×10^5cells，次日進行轉染。
3. 轉染前將培養液換為FGM低血清成纖維細胞培養基。取50μl FGM成纖維細胞培養基，分組加入0.5-0.8μg含有LT cDNA的質粒psv3-neo和含有hTERT cDNA的質粒pCl-Neo-hTERT。
4. 再吸取50μl的FGM成纖維培養基，加入1-2ul脂質體。
5. 分別室溫孵育5分鐘后.將兩者混合，混合后在孵育10-20分鐘（孵育過程中可用移液槍輕輕吹打，使其完全融合）
6. 孵育完成后，加入FGM成纖維培養基 ，擴溶至1ml左右，沿孔壁加入需要感染的細胞中
7. 將轉染細胞放入37℃ CO2孵箱中培養。
8. 轉染后6-10小時換為不含病毒的培養液，細胞接近匯合時，將細胞進行1：5傳代，
9. 繼續培養.待密度接近50％～70％時，加400ug/mL的G418進行篩選.
10. 待出現抗性克隆，濾紙法分離細胞克隆，重新接種培養；

永生化是否成功，做下以下檢測就可以了：

(1)將細胞和未感染的原代細胞進行傳代 ，發現未感染的細胞在經歷的代次中逐漸衰老

(2)核型分析:取轉染并篩選后的處于對數生長期的轉化細胞，進行核型分析檢測;

(3)取轉染后的細胞注入到裸鼠皮下，進行致瘤性檢測:

(4)免疫熒光檢測。檢測沒有問題，恭喜您，永生化成功了， 它就是你的寶寶了 ，你可以給它取個好聽的名字或者代號，也可以用它實現你的科學理想啦。

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