DIFF-rGFP系統：肉眼觀測，可高通量
貓傳染性腹膜炎（FIP）由貓冠狀病毒（FCoV）引起，是一種高致死性疾病，主要表現為滲出型（濕性）和非滲出型（干性）。其中，干性FIP以多器官肉芽腫性病變為特征，胃腸道受累罕見，診治困難。該病曾長期缺乏有效療法，死亡率極高。核苷類似物GS-441524是一種對貓傳染性腹膜炎（FIP）效果顯著的抗病毒藥物，它通過抑制病毒RNA聚合酶來阻斷病毒復制，為FIP治療帶來了新希望。
2025年8月，韓國大邱的慶北國立大學獸醫學院獸醫內科系及獸醫生物醫學科學研究所發表了一篇關于探討一例FIP病毒感染引發橫結腸肉芽腫性病變，并接受GS-441524治療的臨床過程與療效的文獻：
一只7歲去勢雄性家養短毛貓因食欲減退及間歇性嘔吐就診，嘔吐表現為每周一次、單次嘔吐量少但發作頻繁。體格檢查見輕度脫水，未見其他顯著異常。
實驗室檢查顯示：白球比降低（0.5），天冬氨酸氨基轉移酶輕度升高（78 U/L，參考范圍0–48 U/L），輕度白細胞增多（19.84×10?/L，參考范圍2.87–17.02×10?/L），貓血清淀粉樣蛋白A顯著升高（19.9 µg/mL，參考范圍＜5.0 µg/mL）。貓白血病病毒抗原及貓免疫缺陷病毒抗體檢測（使用IDEXX Snap Combo試劑盒）結果為陰性。
影像學方面：腹部超聲見橫結腸區域腸壁層次結構消失、腸壁增厚（圖1A、B），測量厚度分別為8.4 mm與5.9 mm，腸腔未見明確梗阻。鄰近腸系膜淋巴結增大至11.9 × 38.6 mm，呈腫塊樣改變，周圍腹膜脂肪回聲增強（圖1C）。腹部CT進一步證實橫結腸壁異常增厚伴密度增高（圖1D），于中腹部橫斷面可見三個連續、源自腸系膜淋巴結的非典型腫塊，鄰近橫結腸壁。增強掃描門脈期顯示腫塊內部血管較豐富，強化不均勻，可見低密度區（圖1E）。周圍腹膜脂肪間隙出現條索影，提示局部脂肪組織及周圍結構存在炎癥或異常改變。
圖1—患貓的腹部超聲檢查。（A, B） 部分橫結腸腸壁層次結構消失并增厚。（C） 結腸壁病變周圍腹膜脂肪回聲增強，并伴有鄰近腸系膜淋巴結腫大。患貓的計算機斷層掃描。（D） 橫結腸壁異常增厚且放射性密度增高（黃箭頭所示）。（E） 在腹部中部橫斷面水平，觀察到三個連續的、源自腸系膜淋巴結的非典型腫塊。內部實質呈現不均勻強化，并伴有低密度區域（黃箭頭所示）。
超聲引導下病變部位細針抽吸細胞學檢查顯示細胞量稀少，未見明確惡性細胞證據（圖2A）。腸系膜淋巴結涂片可見上皮細胞、間質細胞及成簇脂肪細胞混合分布，背景中脂質空泡增多，提示為非特異性非感染性炎癥病變伴局部脂肪壞死（圖2B）。
組織病理學檢查顯示，受累結腸及淋巴組織均可見重度化膿性肉芽腫性炎癥，主要以巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞浸潤為主（圖2C-E）。炎癥累及全層結腸壁，導致腸壁顯著增厚（圖2C）。H&E染色未發現明確病原體，PAS染色未見真菌結構（圖2F），Fite染色未檢出分枝桿菌（圖2G）。免疫組化染色顯示結腸壁炎癥區域FIP病毒抗原呈強陽性表達（圖2H、I）。
圖2—所獲結腸病變細胞學檢查[Diff-Quik染色，100×（A）]與鄰近腫大腸系膜淋巴結細胞學檢查[Diff-Quik染色，400×（B）]。（A、B） 細胞密度相對較低，未見明確惡性腫瘤證據。提示為非特異性、非感染性炎癥病變伴部分脂肪壞死。所獲結腸病變組織病理學檢查[H&E染色，100×（C）、400×（D）；PAS染色，200×（F）；Fite染色，200×（G）；免疫組化染色，50×（H）、200×（I）]及鄰近腫大腸系膜淋巴結檢查[H&E染色，400×（E）]。（D、E） 可見嚴重化膿性肉芽腫性炎癥，主要成分為巨噬細胞、中性粒細胞及淋巴細胞。該炎癥貫穿增厚結腸壁全層（C），導致腸壁顯著增厚。（F、G） 增厚結腸壁炎癥區域內未見真菌病原體及分枝桿菌屬。（H、I） 增厚結腸壁炎癥區域貓傳染性腹膜炎病毒免疫組化染色呈強陽性。
綜合上述結果，確診該橫結腸局限性病變及相關淋巴結病變由FIP病毒感染引起。
患貓接受GS-441524治療（6 mg/kg，q24h，SC）共12周。治療開始3天后胃腸道癥狀改善，輔助用藥于7天后停用。
活檢時患貓體重約4kg，GS-441524治療前下降至3.5kg。治療后體重持續回升，12周療程結束時達4.6kg，隨訪期間進一步增長至5.72kg，嘔吐癥狀消失。白球比由活檢及治療初期的0.5逐步上升，治療結束時為0.7，后續提升至1.0。貓血清淀粉樣蛋白A（fSAA）從初始19.9 µg/ml升至治療初期25.5 µg/ml，后在療程結束時恢復正常（<5.0 µg/ml）并維持至末次隨訪。
影像學復查顯示，治療結束時橫結腸局部病灶及周圍淋巴結病變完全消退（圖3A），治療后第86周與第308周隨訪見結腸壁結構保持正常（圖3B、C）。FCoV抗體檢測轉陰，全血及糞便FCoV抗原RT-PCR結果均為陰性。血清白球比與fSAA持續處于正常范圍。截至診斷后44個月，患貓經定期隨訪確認仍存活。
圖3—患貓的腹部超聲檢查圖像。
（A) 在12周治療期結束時，橫結腸局部病灶及周圍淋巴結病變均已消退。（B) 治療后第86周隨訪時，以及（C) 治療后第308周隨訪時，結腸壁均保持正常結構。
本病例證實，GS-441524對罕見非典型FIP（表現為局限性橫結腸肉芽腫病變）具有顯著療效。該病例診斷復雜，極易與腫瘤等疾病混淆，凸顯了影像學與組織病理學在鑒別中的重要性。治療后患貓癥狀完全消退，關鍵指標恢復正常且長期無復發，證明了該藥物能有效清除病毒并控制炎癥。這為GS-441524治療非典型FIP提供了有力依據，但其長期安全性仍需進一步研究。上述成功案例源于有效的藥物，而新藥的研發與優化，則需要強大的體外篩選工具作為“引擎”。為此，「DIFF CRO」搭建了專業的貓傳腹體外藥效評價體系。
「DIFF CRO」貓傳腹體外藥效評價
「DIFF CRO」服務平臺可針對FIPV疫苗及藥物進行有效性評價。在候選藥物的細胞水平篩選階段，可進行真病毒小分子藥篩，另外針對貓傳腹的蛋白酶靶點，「DIFF CRO」獨家開發了蛋白酶抑制劑篩選系統以幫助研發企業加速進程，為早日實現合規獸藥、疫苗上市爭取更多時間。
FIPV真病毒小分子藥篩
針對FIP小分子治療藥物，「DIFF CRO」搭建了基于真病毒體系的體外藥效篩選平臺，用于系統評估候選化合物對病毒在細胞內復制過程的抑制能力。該平臺采用標準化培養體系和經過驗證的FIPV真病毒株（見表1），在嚴格的生物安全條件下開展實驗，能夠更真實地反映候選藥物在細胞環境中的抗病毒活性（圖4），為早期藥效判斷和化合物優選提供可靠依據。
表1. 使用的FIPV毒株型別
圖4. GS-441524對FIPV WSU79-1146毒株的抑制率曲線
基于DIFF-rGFP系統的FIPV蛋白酶抑制劑篩選
FIPV病毒的多聚蛋白的裂解由兩種蛋白酶調控：主要蛋白酶（3CLpro，也稱為Mpro或nsp5）和木瓜蛋白酶樣蛋白酶（PLpro）。3CLpro在病毒生命周期中發揮的重要作用，使其成為藥物設計的一個有吸引力的重要靶點。而由「DIFF CRO」獨家開發的蛋白酶抑制劑篩選系統（DIFF-rGFP ），可在細胞水平直接模擬病毒自然感染過程，杜絕漏篩和假陽性等情況，在新藥早期發現階段快速篩選大量化合物，其擁有諸多優勢：
1）最簡便：肉眼觀測
DIFF-rGFP可通過肉眼直接觀察藥物反應的熒光變化（圖5），進行定性判斷。
圖5. 使用DIFF-rGFP進行FIPV陽性藥物GC376篩選的熒光變化圖
2）最準確：原理可靠
DIFF-rGFP 是基于特制質粒的共表達機制，以FIPV為例，結合重組綠色熒光蛋白（rGFP）和FIPV的3CL蛋白酶。在該系統中，rGFP序列中嵌入了3CL蛋白酶的特異性切割位點。當3CL蛋白酶功能正常時，會特異性裂解rGFP，導致其熒光功能喪失，熒光強度減弱。相反，當抑制劑有效抑制了3CL蛋白酶的活性時，rGFP無法被切割，維持其完整性并正常發出熒光，熒光強度增強（圖6）。藥物有效性與熒光強度成正相關，是一種更直觀的正向篩選方式。
圖6.DIFF-rGFP工作原理圖
3）快速高效的高通量篩選
系統檢測的熒光值低而信噪比好，可聯合現有藥物庫，一周即可篩選1萬-10萬個抗FIPV藥物候選化合物，快速鎖定有效藥物（圖7）。
圖7. 高通量篩選操作示意圖
4）穩定且可重復
DIFF-rGFP 檢測呈現出更漸進的反應，因為它測量的是熒光強度，而不是直接測量病毒復制情況（圖8）。這種更平穩的反應可能會縮小檢測的動態范圍，但能提供更穩定且可重復的檢測結果。
圖8.DIFF-rGFP檢測的半數有效濃度（EC50）
「DIF CRO」憑借其獨有的DIFF-rGFP蛋白酶抑制劑篩選系統，為FIPV藥物研發提供了簡便直觀、準確可靠、高效快速且穩定可重復的體外藥效評價方案。該平臺將復雜篩選過程轉化為直觀的熒光信號，結合真病毒藥篩，構成多方法評估體系，能極大加速候選化合物的早期發現與優化進程，是助力新一代貓傳腹療法從實驗室走向臨床的關鍵加速器。
參考文獻：Kim TY, Oh YI. GS-441524 Treatment in a Cat With Feline Infectious Peritonitis Virus and Pyogranulomatous Transverse Colon Lesion. In Vivo. 2025 Sep-Oct;39(5):2760-2765.