研究背景：
外泌體熒光標(biāo)記是外泌體功能研究中的必要的技術(shù)，然而在實(shí)際操作中對(duì)于使用多少的外泌體、加入多少的熒光染料、以及最終標(biāo)記的效率是多少，這些問題都是不清楚的，給操作人員帶來了不少困擾。
本研究目的是使用不同劑量的熒光染料標(biāo)記外泌體，通過納米流式儀檢測外泌體熒光效率以及染色后外泌體重新純化后的熒光效率。
材料與儀器：
細(xì)胞株：293T (ATCC, CRL-3216)
外泌體提取試劑盒（Umibio, UR52121）
納米流式檢測儀 （NanoFCM, N30E）
相關(guān)試劑：
外泌體專用無血清培養(yǎng)基 (Umibio，UR51102)
PKH67綠色熒光標(biāo)記染料 (Umibio，UR52303)
實(shí)驗(yàn)方法：
細(xì)胞培養(yǎng)
293T細(xì)胞通過外泌體專用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，收集細(xì)胞上清液，通過0.45 um濾器過濾處理。
外泌體分離提取
通過Umibio細(xì)胞上清液外泌體提取試劑盒的說明書進(jìn)行操作，提取的外泌體通過納米流式檢測儀進(jìn)行顆粒濃度和BCA方法進(jìn)行蛋白濃度測定。
外泌體熒光染料標(biāo)記
配制染料工作液：用Diluent C試劑（染色試劑盒自帶）稀釋染料儲(chǔ)存液，配制濃度為100 nM的染料工作液(PKH67)；
稀釋染料工作液：按照2倍梯度通過Diluent C稀釋100 nM的染料工作液；
向各實(shí)驗(yàn)組中加入10 uL對(duì)應(yīng)濃度的染料，混勻后取10 uL進(jìn)行納米流式檢測；
在標(biāo)記的外泌體樣品中補(bǔ)加入1 mL的PBS,使用試劑盒再次提取外泌體以去除游離染料；
沉淀用100 ul PBS重懸，再次進(jìn)行納米流式檢測。
外泌體熒光效率檢測
納米流式上機(jī)檢測（具體SOP見微信公眾號(hào)）
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
293T-Exosome檢測：
Fig.1 外泌體電鏡（A）和顆粒檢測（B）
提取的外泌體通過BCA方法檢測，外泌體總蛋白濃度為0.882 mg/mL; 通過納米流式儀檢測顆粒濃度為6.0E+10 particles/mL。
外泌體熒光染料標(biāo)記分組
Group 1：Exosome（ 0 ug）+染料（100 nM，10 uL） 染料終濃度：100 nM
Group 2：Exosome（10ug）+ 染料（100 nM, 10 uL） 染料終濃度：50 nM
Group 3：Exosome（10ug）+ 染料（50 nM, 10 uL） 染料終濃度：25 nM
Group 4：Exosome（10ug）+ 染料（25 nM, 10 uL） 染料終濃度：12.5 nM
Group 5：Exosome（10ug）+ 染料（12.5 nM , 10 uL） 染料終濃度：6.25 nM
Group 6：Exosome（10ug）+ 染料（6.25 nM, 10 uL） 染料終濃度：3.125 nM
Group 7：Exosome（10ug）+ 染料（3.125 nM, 10 uL） 染料終濃度：1.5625 nM
以ddH2O作為對(duì)照組校準(zhǔn)基線。
外泌體熒光標(biāo)記效率檢測
3.1染色后外泌體顆粒濃度變化趨勢：
100nM純?nèi)玖辖M中未加入外泌體顆粒，其他各組中初始外泌體濃度為3E+10 particles/mL，均為20 uL體系。圖2是染色后的外泌體的顆粒濃度變化曲線圖，100nM純?nèi)玖辖M中檢測到5.7E+10 particles/mL的顆粒物，超出初始外泌體濃度，推測該顆粒為染料聚集物。50nM組中有3.71E+10 particles/mL的顆粒物，也高于初始外泌體濃度，推測該組中染料劑量過量，存在染料聚集物。
1.5625nM組和3.125nM組中顆粒濃度小于1E+10 particles/mL，推測染料中Diluent C稀釋液對(duì)外泌體有一定的影響作用，可能會(huì)破壞外泌體。
Fig.2 染色后顆粒濃度（Particle/mL）
3.2 染色后熒光外泌體比例：
100nM和50nM兩個(gè)純?nèi)玖辖M中染料過量，熒光顆粒比例分別為81%和71.2%，其他各組的熒光外泌體比例均在35%以下。
Fig. 3&4染色后熒光外泌體比例及趨勢
3.3 重新提取后熒光外泌體比例：
通過針對(duì)染色的外泌體進(jìn)行2次提取，以去除多余的染料，在染料過量組100nM和50nM組中，熒光比例由最初的81%和71.2%下降到11.5%和23.3%；染料低劑量組中的熒光比例變化差異不是非常大，其中25nM在前后兩次檢測時(shí)，熒光比例都在30%左右，相對(duì)穩(wěn)定且熒光比例較高。
Fig.5重提染色后熒光外泌體比例及趨勢
實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)，可以得到一些初步結(jié)論：
在低劑量染料作用下（染料不過量時(shí)，25nM以內(nèi)），在外泌體溶液中加入染料以及做二次提純外泌體，外泌體的熒光比例變化不大（<5%）；染料在此劑量范圍內(nèi)使用時(shí)，可以不用進(jìn)行外泌體的二次提純操作，減少外泌體的損失；
在高劑量染料作用下（染料過量時(shí)， 50nM以上），在外泌體溶液中加入染料以及做二次離心提純外泌體，外泌體的熒光比例變化顯著（>40%）；染料在此劑量范圍內(nèi)使用時(shí)，必須進(jìn)行外泌體的二次提純操作，減少染料對(duì)于后期實(shí)驗(yàn)的影響；
在本次測試中25nM組，熒光效率較高，二次提取前后的變化不大，推薦染料使用濃度在20nM-25nM之間。
補(bǔ)充數(shù)據(jù)：
外泌體與細(xì)胞共孵育實(shí)驗(yàn)
25nM PKH67標(biāo)記293T-Exosome后，與A549細(xì)胞共孵育2小時(shí)后，進(jìn)行共聚焦觀察；
Fig.6 熒光外泌體共孵育檢測
參考文獻(xiàn)：
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