免疫細胞化學（Immunocytochemistry，ICC）是根據抗原及抗體間專一性結合反應的原理，使用熒光抗體或染料來檢測細胞內靶抗原（如蛋白）的技術，其所需樣品為細胞，因常使用熒光標記所以在應用上常常寫成ICC/IF。由于ICC/IF具有特異性強、敏感性高、速度快等優點，又可以完整觀察細胞型態與目標抗原相對位置，因此被廣泛應用于科研領域。
ICC步驟如下圖所示，需將細胞固定在蓋玻片上經過通透、一抗二抗染色等步驟, 最后成像。
GeneTex可提供一系列用于ICC的優質抗體，對于ICC實驗有著豐富的經驗。在此與大家分享當遇到ICC染色形態不佳/信號定位不正確的情況，應該如何解決？
檢查以下2點，一切都搞定！
1、檢查細胞爬片 2、檢查固定與通透
1、細胞爬片制備
重點1.1、細胞黏附好，形態才會好
a、蓋玻片處理： 通常細胞在蓋玻片上的黏附能力都不強，可以使用幾種成分鋪在蓋玻片上，以增強細胞與玻璃蓋玻片的黏附。常用的溶液成分如下表，不同的細胞需進行個別的調整，以得到最佳的結果。
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一般藥品 |
細胞外基質蛋白 |
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Poly-lysine (0.05-0.1mg/ml) |
Laminin (0.05-0.1mg/ml) |
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Poly-ornithine (0.1mg/ml) |
Fibronectin (0.05-0.1mg/ml) |
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HCl (0.1-1M) |
Gelatin (0.1%) Collagen (0.05-0.1g/ml) |
b、細胞狀態和密度：細胞的健康狀態、型態與密度，可能會影響靶標蛋白的表達與定位。一般使用分盤后培養隔夜(時間太短細胞貼附不完全，太長細胞會太老不健康)，細胞密度約50-70 %的爬片。密度太高或太低都可能對靶標蛋白的定位產生負面的影響，需要根據靶標特性調整適宜的細胞類型與密度。例如在研究細胞連接標記蛋白時，維持細胞與細胞間的接觸就特別重要，選擇較容易觀察到細胞連接的細胞種類，最佳細胞密度也要有80%以上。
c、細胞培養條件：有些靶標蛋白的表達和定位，隨著細胞周期或細胞應激反應而變化，須確保用來制作爬片的細胞狀態為觀察靶標蛋白的最佳條件。例如觀察細胞分裂相關蛋白，可將細胞做同步處理，使細胞處于同一個細胞周期階段，否則就需要在細胞爬片中仔細觀察靶標蛋白的信號；又如觀察自噬反應中的LC3B蛋白，如未加入誘發細胞展開自噬的藥物，將較難觀察到正確的定位結果。
重點1.2、懸浮細胞有訣竅
a、分盤時，將細胞懸浮溶液接種于涂層處理過的蓋玻片上，接著即可比照黏附型細胞的實驗步驟。
b、在細胞懸浮溶液中進行固定步驟，利用細胞離心技術（CytospinTM）將細胞低速離心至涂層處理過的蓋玻片上，也可以用移液管吸取細胞懸浮液滴于已涂層的蓋玻片上。
c、在懸浮狀態中進行完所有染色步驟，最后用移液管移至器皿或載玻片上進行顯微鏡成像。
d、小星獅技巧：可以將固定后的懸浮細胞溶液與2-3 %的瓊脂等比例混合，將細胞檢體包覆，待瓊脂膠體凝固后，再按照常規的脫水、包埋程序做石蠟包埋，制作成的細胞蠟塊，之后再進行組織切片，此玻片樣本可照一般石蠟組織切片IHC的操作方法進行免疫化學染色。與一般ICC最大的不同為：此組織蠟塊制作的玻片需烤過，再進行脫蠟與回水，也需要進行抗原修復的步驟，基本上是當作IHC進行實驗，對于較難得到的細胞樣本（如病毒感染的細胞），可用此方法保存細胞蠟塊，日后若有需要只要進行切片即有樣本。
2、固定和通透處理
樣品的固定與通透對實驗結果影響很大，最適合的固定與通透方法，與細胞類型、靶標蛋白和使用的抗體有關，嘗試不同的固定和通透條件，將有助于得到靶標蛋白在抗體染色的最佳信號與正確定位。
a、固定劑的選擇：固定劑主要有兩大類，交聯劑（如多聚甲醛）與有機溶劑（如甲醇或丙酮）。
交聯劑通過疏水性交聯把蛋白與蛋白連起來；有機溶劑能使細胞脫水，把蛋白質沉淀在細胞結構上，也具有細胞通透的性能。多聚甲醛、甲醇和丙酮等都是很常用的固定劑，建議最初從4% PFA，固定15分鐘開始嘗試，倘若沒有達到預期效果，再調整固定時間或更換另一種固定劑。
GeneTex在固定劑的使用經驗整理如下表，但仍須根據靶標蛋白或抗體的不同逐步調整出最佳方案。
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靶標蛋白類型 |
較合適固定劑 |
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細胞膜 |
交聯劑 |
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細胞質 |
交聯劑/有機溶劑 |
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細胞骨架 |
有機溶劑/交聯劑 |
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高爾基體 |
交聯劑/有機溶劑 |
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細胞核 |
交聯劑 |
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細胞核膜 |
有機溶劑/交聯劑 |
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細胞核仁 |
有機溶劑 |
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內質網 |
交聯劑 |
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中心體 |
有機溶劑 |
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紡錘體 |
有機溶劑/交聯劑 |
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溶酶體 |
有機溶劑/交聯劑 |
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線粒體 |
有機溶劑 |
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自噬體 |
有機溶劑 |
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翻譯后修飾化靶標蛋白（PTM） |
交聯劑 |
b、通透條件的選擇：
由于抗體無法直接穿過數十微米的細胞質膜進入細胞，因此檢測胞內的靶標蛋白時，需進行通透化處理，利用除垢劑在細胞膜形成孔洞，使得抗體得以進入細胞內。常用的除垢劑有Triton® X-100, NP-40, Tween 20或皂甘等，建議從0.1 % Triton® X-100，通透5分鐘開始嘗試，倘若沒有達到預期效果，再調整通透時間或通透劑濃度，也可以考慮更換另一種通透劑，有機溶劑固定劑會引發細胞變性脫水，因此也會破壞細胞膜的完整性，不太適合細胞膜靶標蛋白染色。一般來說，有機溶劑固定之后也不建議進行細胞通透的步驟。最佳的細胞通透方法，一樣需要根據靶標蛋白與所使用的抗體而調整，無法用一種方法套用到所有的實驗
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