免疫細(xì)胞化學(xué)（Immunocytochemistry，ICC）是根據(jù)抗原及抗體間專一性結(jié)合反應(yīng)的原理，使用熒光抗體或染料來檢測細(xì)胞內(nèi)靶抗原（如蛋白）的技術(shù)，其所需樣品為細(xì)胞，因常使用熒光標(biāo)記所以在應(yīng)用上常常寫成ICC/IF。由于ICC/IF具有特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快等優(yōu)點(diǎn)，又可以完整觀察細(xì)胞型態(tài)與目標(biāo)抗原相對位置，因此被廣泛應(yīng)用于科研領(lǐng)域。
ICC步驟如下圖所示，需將細(xì)胞固定在蓋玻片上經(jīng)過通透、一抗二抗染色等步驟, 最后成像。
GeneTex可提供一系列用于ICC的優(yōu)質(zhì)抗體，對于ICC實(shí)驗(yàn)有著豐富的經(jīng)驗(yàn)。在此與大家分享當(dāng)遇到ICC染色形態(tài)不佳/信號定位不正確的情況，應(yīng)該如何解決？
檢查以下2點(diǎn)，一切都搞定！
1、檢查細(xì)胞爬片 2、檢查固定與通透
1、細(xì)胞爬片制備
重點(diǎn)1.1、細(xì)胞黏附好，形態(tài)才會好
a、蓋玻片處理： 通常細(xì)胞在蓋玻片上的黏附能力都不強(qiáng)，可以使用幾種成分鋪在蓋玻片上，以增強(qiáng)細(xì)胞與玻璃蓋玻片的黏附。常用的溶液成分如下表，不同的細(xì)胞需進(jìn)行個別的調(diào)整，以得到最佳的結(jié)果。
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一般藥品 |
細(xì)胞外基質(zhì)蛋白 |
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Poly-lysine (0.05-0.1mg/ml) |
Laminin (0.05-0.1mg/ml) |
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Poly-ornithine (0.1mg/ml) |
Fibronectin (0.05-0.1mg/ml) |
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HCl (0.1-1M) |
Gelatin (0.1%) Collagen (0.05-0.1g/ml) |
b、細(xì)胞狀態(tài)和密度：細(xì)胞的健康狀態(tài)、型態(tài)與密度，可能會影響靶標(biāo)蛋白的表達(dá)與定位。一般使用分盤后培養(yǎng)隔夜(時間太短細(xì)胞貼附不完全，太長細(xì)胞會太老不健康)，細(xì)胞密度約50-70 %的爬片。密度太高或太低都可能對靶標(biāo)蛋白的定位產(chǎn)生負(fù)面的影響，需要根據(jù)靶標(biāo)特性調(diào)整適宜的細(xì)胞類型與密度。例如在研究細(xì)胞連接標(biāo)記蛋白時，維持細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸就特別重要，選擇較容易觀察到細(xì)胞連接的細(xì)胞種類，最佳細(xì)胞密度也要有80%以上。
c、細(xì)胞培養(yǎng)條件：有些靶標(biāo)蛋白的表達(dá)和定位，隨著細(xì)胞周期或細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)而變化，須確保用來制作爬片的細(xì)胞狀態(tài)為觀察靶標(biāo)蛋白的最佳條件。例如觀察細(xì)胞分裂相關(guān)蛋白，可將細(xì)胞做同步處理，使細(xì)胞處于同一個細(xì)胞周期階段，否則就需要在細(xì)胞爬片中仔細(xì)觀察靶標(biāo)蛋白的信號；又如觀察自噬反應(yīng)中的LC3B蛋白，如未加入誘發(fā)細(xì)胞展開自噬的藥物，將較難觀察到正確的定位結(jié)果。
重點(diǎn)1.2、懸浮細(xì)胞有訣竅
a、分盤時，將細(xì)胞懸浮溶液接種于涂層處理過的蓋玻片上，接著即可比照黏附型細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)步驟。
b、在細(xì)胞懸浮溶液中進(jìn)行固定步驟，利用細(xì)胞離心技術(shù)（CytospinTM）將細(xì)胞低速離心至涂層處理過的蓋玻片上，也可以用移液管吸取細(xì)胞懸浮液滴于已涂層的蓋玻片上。
c、在懸浮狀態(tài)中進(jìn)行完所有染色步驟，最后用移液管移至器皿或載玻片上進(jìn)行顯微鏡成像。
d、小星獅技巧：可以將固定后的懸浮細(xì)胞溶液與2-3 %的瓊脂等比例混合，將細(xì)胞檢體包覆，待瓊脂膠體凝固后，再按照常規(guī)的脫水、包埋程序做石蠟包埋，制作成的細(xì)胞蠟塊，之后再進(jìn)行組織切片，此玻片樣本可照一般石蠟組織切片IHC的操作方法進(jìn)行免疫化學(xué)染色。與一般ICC最大的不同為：此組織蠟塊制作的玻片需烤過，再進(jìn)行脫蠟與回水，也需要進(jìn)行抗原修復(fù)的步驟，基本上是當(dāng)作IHC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對于較難得到的細(xì)胞樣本（如病毒感染的細(xì)胞），可用此方法保存細(xì)胞蠟塊，日后若有需要只要進(jìn)行切片即有樣本。
2、固定和通透處理
樣品的固定與通透對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很大，最適合的固定與通透方法，與細(xì)胞類型、靶標(biāo)蛋白和使用的抗體有關(guān)，嘗試不同的固定和通透條件，將有助于得到靶標(biāo)蛋白在抗體染色的最佳信號與正確定位。
a、固定劑的選擇：固定劑主要有兩大類，交聯(lián)劑（如多聚甲醛）與有機(jī)溶劑（如甲醇或丙酮）。
交聯(lián)劑通過疏水性交聯(lián)把蛋白與蛋白連起來；有機(jī)溶劑能使細(xì)胞脫水，把蛋白質(zhì)沉淀在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上，也具有細(xì)胞通透的性能。多聚甲醛、甲醇和丙酮等都是很常用的固定劑，建議最初從4% PFA，固定15分鐘開始嘗試，倘若沒有達(dá)到預(yù)期效果，再調(diào)整固定時間或更換另一種固定劑。
GeneTex在固定劑的使用經(jīng)驗(yàn)整理如下表，但仍須根據(jù)靶標(biāo)蛋白或抗體的不同逐步調(diào)整出最佳方案。
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靶標(biāo)蛋白類型 |
較合適固定劑 |
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細(xì)胞膜 |
交聯(lián)劑 |
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細(xì)胞質(zhì) |
交聯(lián)劑/有機(jī)溶劑 |
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細(xì)胞骨架 |
有機(jī)溶劑/交聯(lián)劑 |
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高爾基體 |
交聯(lián)劑/有機(jī)溶劑 |
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細(xì)胞核 |
交聯(lián)劑 |
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細(xì)胞核膜 |
有機(jī)溶劑/交聯(lián)劑 |
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細(xì)胞核仁 |
有機(jī)溶劑 |
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內(nèi)質(zhì)網(wǎng) |
交聯(lián)劑 |
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中心體 |
有機(jī)溶劑 |
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紡錘體 |
有機(jī)溶劑/交聯(lián)劑 |
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溶酶體 |
有機(jī)溶劑/交聯(lián)劑 |
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線粒體 |
有機(jī)溶劑 |
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自噬體 |
有機(jī)溶劑 |
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翻譯后修飾化靶標(biāo)蛋白（PTM） |
交聯(lián)劑 |
b、通透條件的選擇：
由于抗體無法直接穿過數(shù)十微米的細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞，因此檢測胞內(nèi)的靶標(biāo)蛋白時，需進(jìn)行通透化處理，利用除垢劑在細(xì)胞膜形成孔洞，使得抗體得以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。常用的除垢劑有Triton® X-100, NP-40, Tween 20或皂甘等，建議從0.1 % Triton® X-100，通透5分鐘開始嘗試，倘若沒有達(dá)到預(yù)期效果，再調(diào)整通透時間或通透劑濃度，也可以考慮更換另一種通透劑，有機(jī)溶劑固定劑會引發(fā)細(xì)胞變性脫水，因此也會破壞細(xì)胞膜的完整性，不太適合細(xì)胞膜靶標(biāo)蛋白染色。一般來說，有機(jī)溶劑固定之后也不建議進(jìn)行細(xì)胞通透的步驟。最佳的細(xì)胞通透方法，一樣需要根據(jù)靶標(biāo)蛋白與所使用的抗體而調(diào)整，無法用一種方法套用到所有的實(shí)驗(yàn)
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