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1.1. 試劑配制

• 凝膠濃度精準(zhǔn)匹配：蛋白電泳需根據(jù)目標(biāo)分子量調(diào)整分離膠濃度（小分子蛋白選 12%-15%，大分子選 8%-10%），核酸電泳則按片段長(zhǎng)度選瓊脂糖濃度（100-500bp 用1.5%-2%，1-10kb 用 0.8%-1%），濃度偏高會(huì)導(dǎo)致條帶拖尾，偏低易使條帶擴(kuò)散。

 萬(wàn)生昊天GSG系列蛋白預(yù)制膠遷移率圖譜

• 緩沖液現(xiàn)配現(xiàn)用：Tris-甘氨酸緩沖液（蛋白）、TAE/TBE 緩沖液（核酸）需新鮮配制，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致離子強(qiáng)度變化；核酸電泳緩沖液可加入終濃度 0.5 μg/mL 的 EB 或無(wú)毒染料，無(wú)需額外染色步驟。

• 樣品處理避坑：蛋白樣品需加入 loading buffer 后 95℃加熱 5-10 分鐘變性，冷卻后離心再上樣（防止樣品飄出加樣孔）；核酸樣品避免反復(fù)凍融，可加入 RNA 酶抑制劑防止降解，上樣前用 ddH2O 調(diào)整濃度至統(tǒng)一梯度。

1.2. 器材檢查

• 電泳槽清洗：用去離子水沖洗電極和槽體，去除殘留凝膠或緩沖液結(jié)晶，避免短路或條帶扭曲；

• 凝膠板密封：組裝模具時(shí)確保密封條緊密貼合，倒入凝膠前先加少量分離膠測(cè)試是否漏液，漏液需重新調(diào)整模具；

• 電源校準(zhǔn)：確認(rèn)電源正負(fù)極連接正確（蛋白電泳上樣孔側(cè)為負(fù)極，核酸電泳同理），提前設(shè)置好電壓參數(shù)（恒壓模式更穩(wěn)定）。

2.1. 凝膠制備與凝固

• 分離膠與濃縮膠比例：蛋白電泳濃縮膠濃度固定為 4%，高度約 1cm（幫助樣品聚焦），分離膠高度根據(jù)樣品量調(diào)整（一般占凝膠板 2/3）；

• 凝膠凝固技巧：倒入凝膠后立即在表面覆蓋一層無(wú)水乙醇或異丙醇，隔絕空氣加速凝固，同時(shí)避免膠面出現(xiàn)凹陷，凝固時(shí)間至少 30 分鐘（室溫較低時(shí)可放入 37℃恒溫箱縮短時(shí)間）。

2.2. 上樣與電泳參數(shù)

• 上樣量控制：蛋白電泳每孔上樣量 5-20 μg，核酸電泳每孔 10-50 ng，避免上樣過(guò)多導(dǎo)致條帶重疊，過(guò)少則無(wú)法顯色；上樣時(shí)槍頭需插入加樣孔底部緩慢推注，避免產(chǎn)生氣泡。

• 電壓設(shè)置：蛋白電泳濃縮膠階段用 80V，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后調(diào)至 120-150V；核酸電泳恒壓 5-10 V/cm（凝膠長(zhǎng)度），小分子片段用較高電壓（縮短電泳時(shí)間），大分子用較低電壓（保證分離效果）。

• 電泳終止時(shí)機(jī)：蛋白電泳待溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部 1cm 處停止，核酸電泳根據(jù) Marker 遷移位置判斷（目標(biāo)條帶與 Marker 對(duì)應(yīng)位置一致時(shí)終止），避免過(guò)度電泳導(dǎo)致條帶跑出凝膠。

2.3. 染色與顯影優(yōu)化

• 蛋白染色：考馬斯亮藍(lán)染色需用染色液加熱至95℃后，搖床脫色 0.5-1小時(shí)；脫色液加熱至95℃后，搖床脫色 0.5-1小時(shí)，根據(jù)脫色效果，可重復(fù)更換 1-2 次脫色液，可加入少量甘油防止凝膠干裂；銀染法靈敏度更高，適合低豐度蛋白，但需嚴(yán)格控制染色和顯影時(shí)間（避免背景過(guò)深）。

• 核酸顯影：EB 染色后用紫外凝膠成像儀觀察，曝光時(shí)間控制在 10-30 秒（避免過(guò)度曝光導(dǎo)致條帶模糊）；無(wú)毒染料（如 GoldView）可在電泳過(guò)程中實(shí)時(shí)觀察，無(wú)需額外染色步驟，更安全高效。

• “新鮮” 是基礎(chǔ)：試劑、樣品盡量現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長(zhǎng)時(shí)間存放導(dǎo)致性能下降；

• “匹配” 是關(guān)鍵：凝膠濃度、電壓、上樣量需根據(jù)目標(biāo)分子大小精準(zhǔn)匹配，不可一概而論；

• “耐心” 是保障：凝膠凝固、脫色、顯影等步驟需足夠時(shí)間，避免急于求成導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。