為什么有的蛋白電泳呈現清晰單一條帶，有的卻能觀察到完整復合物？為什么有的實驗需要加熱煮沸，有的卻必須低溫操作？答案在于凝膠系統的選擇——非變性電泳（Native-PAGE） 與 變性電泳（SDS-PAGE）。兩者基于相同原理，卻在分離機制和應用場景上有著本質區別。
本文將分上下兩篇，系統解析兩種技術的異同，并整理非變性電泳實操全攻略，助您一步到位掌握核心要點。
兩種技術的核心差異
蛋白質在電泳過程中保持其天然構象，遷移速率由天然電荷密度、分子大小和空間構象共同決定。其中，蛋白質的等電點（pI） 是最關鍵的調控因素。由于體系中不含SDS等變性劑，蛋白質的固有電荷未被掩蓋，因此不同蛋白質的電荷異質性得以保留，遷移行為由其綜合物化屬性決定。
1.2 SDS-PAGE
在陰離子去垢劑SDS存在下，蛋白質被完全變性并解聚為多肽鏈。SDS以恒定比例（1.4 g SDS / g 蛋白）與蛋白質結合，有效屏蔽蛋白質的固有電荷，使所有蛋白質-SDS復合物均帶有均勻的負電荷密度。同時，SDS誘導蛋白質從天然構象轉變為無規卷曲/長桿狀，消除了形狀對遷移的影響。最終，蛋白質的遷移速率僅與其分子量的對數呈線性相關——分子量越小，遷移距離越大。
2.1 Native-PAGE
• 蛋白質狀態：保持天然三維構象，生物活性得以保留，亞基間相互作用及寡聚化狀態完整。
• 電荷特征：蛋白質攜帶其固有凈電荷。大多數蛋白質的等電點（pI）在3-8之間，在常規Tris-甘氨酸緩沖體系（pH ~8.3）中帶負電，因此向陽極遷移；若蛋白質pI＞7（堿性蛋白），則需反轉電極極性以實現有效分離。
• 可觀測信息：可直接解析蛋白質的天然寡聚狀態（如單體、二聚體、多聚體）及蛋白質復合物組成，電泳后還可進行原位酶活性染色或同工酶分析。
2.2 SDS-PAGE
• 蛋白質狀態：完全變性、解聚為多肽鏈，天然構象及生物活性喪失。
• 電荷特征：所有蛋白質-SDS復合物均帶負電荷，因此在電場中均向陽極遷移。
• 可觀測信息：獲得單一亞基的清晰條帶，可根據條帶相對遷移距離推算表觀分子量，適用于蛋白質表達分析、純度鑒定等。
3.1 Native-PAGE
• 天然蛋白質復合物的分離與分析：從組織勻漿或膜組分中一步分離具有生物學活性的蛋白質復合物。
• 寡聚狀態及相互作用研究：確定蛋白質的天然分子量、亞基組成及生理條件下的蛋白質-蛋白質相互作用。
• 功能活性檢測：電泳后直接進行酶活性染色、配體結合分析等功能性實驗。
• 結構生物學樣品制備：從凝膠中回收天然蛋白質復合物，用于二維結晶、負染電鏡等結構解析前處理。
3.2 SDS-PAGE
• 分子量測定：根據標準曲線計算蛋白質亞基的表觀分子量。
• 蛋白質表達分析：檢測目標蛋白質的表達水平、誘導表達效果及樣品間差異。
• Western blot前處理：變性后的蛋白質更易于與抗體結合，是免疫印跡實驗的標準流程。
• 純度評估：監測蛋白質純化過程中各流份的純度和降解情況。
4.1 Native-PAGE
? 保留蛋白質天然構象與活性，可獲得功能相關的結構信息
? 支持電泳后直接進行功能檢測，無需額外復性步驟
? 實驗條件需優化（如緩沖液pH、凝膠濃度、電極方向），操作復雜度較高
? 遷移行為受多重因素影響，無法直接推算分子量
4.2 SDS-PAGE
? 操作標準化程度高，實驗重復性好，適用范圍廣
? 分子量測定準確，數據易于定量分析
? 樣品處理簡單（熱變性即可），適合高通量分析
? 蛋白質完全變性，無法獲得天然構象及功能相關信息
非變性電泳（Native-PAGE）操作全攻略
關鍵要點：
• 所有的預染蛋白Marker均為SDS-PAGE設計，不適用于非變性電泳。
• 非變性條件下，蛋白質遷移受電荷、形狀和分子量共同影響，因此在單一凝膠濃度下，非變性蛋白Marker無法精確推算目標蛋白的分子量。
• 如需確定非變性條件下蛋白質的分子量，應在不同凝膠濃度下測定蛋白質的相對遷移率（Rf值），繪制凝膠濃度對Rf的曲線進行推算。
• 非變性蛋白專用Marker為保持天然結構，均未偶聯染料，電泳過程中不可見。如需檢測非變性蛋白Marker的轉膜效果，可使用麗春紅染色液，但需注意其靈敏度較低，可能無法顯示完整條帶。
推薦產品： MKPZ010 非變性蛋白 Marker (66-669 kDa)
關鍵要點：
• 必須使用非變性上樣緩沖液，確保不含SDS、DTT等變性劑。
• 嚴禁加熱樣品，室溫或冰上操作即可，避免熱誘導變性。
關鍵要點：
• 凝膠和電泳緩沖液中均不得添加SDS。
• 常規蛋白質（pI 3-8）按常規方向電泳（向陽極遷移）；若目標蛋白pI＞7（堿性蛋白），需反轉電極電泳，常規蛋白（pI＜7）按常規向陽極遷移；
• 電泳過程中產熱可能導致蛋白質變性，建議在電泳槽外置冰浴降溫。
• 非變性條件下蛋白質分子量較大，推薦使用5%-10%的凝膠濃度。
• 非變性蛋白質荷質比較低，泳動速度較慢，需適當延長電泳時間。
關鍵要點：
• 轉膜緩沖液中的甲醇對蛋白質有固定作用，非變性轉膜應少加或不加甲醇。
• 以下轉膜條件為通用參考值，建議根據目標蛋白特性進行1-2次預實驗優化：
• 膜孔徑選擇：>20 kD蛋白選用0.45 μm孔徑，≤20 kD蛋白選用0.22 μm孔徑。PVDF膜使用前需用無水甲醇潤濕活化。
只要抓住 “保留天然狀態” 這一核心，嚴格把控樣品、電泳、轉膜的每一個細節，避開變性雷區，非變性電泳也能輕松做好。
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Native-PAGE 與 SDS-PAGE：前者解析天然狀態，后者聚焦分子量信息。
明確實驗目的，選擇適配方法，方能獲得可靠的實驗結果。
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