為什么有的蛋白電泳呈現(xiàn)清晰單一條帶，有的卻能觀察到完整復(fù)合物？為什么有的實(shí)驗(yàn)需要加熱煮沸，有的卻必須低溫操作？答案在于凝膠系統(tǒng)的選擇——非變性電泳（Native-PAGE） 與 變性電泳（SDS-PAGE）。兩者基于相同原理，卻在分離機(jī)制和應(yīng)用場景上有著本質(zhì)區(qū)別。
本文將分上下兩篇，系統(tǒng)解析兩種技術(shù)的異同，并整理非變性電泳實(shí)操全攻略，助您一步到位掌握核心要點(diǎn)。
兩種技術(shù)的核心差異
蛋白質(zhì)在電泳過程中保持其天然構(gòu)象，遷移速率由天然電荷密度、分子大小和空間構(gòu)象共同決定。其中，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI） 是最關(guān)鍵的調(diào)控因素。由于體系中不含SDS等變性劑，蛋白質(zhì)的固有電荷未被掩蓋，因此不同蛋白質(zhì)的電荷異質(zhì)性得以保留，遷移行為由其綜合物化屬性決定。
1.2 SDS-PAGE
在陰離子去垢劑SDS存在下，蛋白質(zhì)被完全變性并解聚為多肽鏈。SDS以恒定比例（1.4 g SDS / g 蛋白）與蛋白質(zhì)結(jié)合，有效屏蔽蛋白質(zhì)的固有電荷，使所有蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物均帶有均勻的負(fù)電荷密度。同時，SDS誘導(dǎo)蛋白質(zhì)從天然構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)卷曲/長桿狀，消除了形狀對遷移的影響。最終，蛋白質(zhì)的遷移速率僅與其分子量的對數(shù)呈線性相關(guān)——分子量越小，遷移距離越大。
2.1 Native-PAGE
• 蛋白質(zhì)狀態(tài)：保持天然三維構(gòu)象，生物活性得以保留，亞基間相互作用及寡聚化狀態(tài)完整。
• 電荷特征：蛋白質(zhì)攜帶其固有凈電荷。大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）在3-8之間，在常規(guī)Tris-甘氨酸緩沖體系（pH ~8.3）中帶負(fù)電，因此向陽極遷移；若蛋白質(zhì)pI＞7（堿性蛋白），則需反轉(zhuǎn)電極極性以實(shí)現(xiàn)有效分離。
• 可觀測信息：可直接解析蛋白質(zhì)的天然寡聚狀態(tài)（如單體、二聚體、多聚體）及蛋白質(zhì)復(fù)合物組成，電泳后還可進(jìn)行原位酶活性染色或同工酶分析。
2.2 SDS-PAGE
• 蛋白質(zhì)狀態(tài)：完全變性、解聚為多肽鏈，天然構(gòu)象及生物活性喪失。
• 電荷特征：所有蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物均帶負(fù)電荷，因此在電場中均向陽極遷移。
• 可觀測信息：獲得單一亞基的清晰條帶，可根據(jù)條帶相對遷移距離推算表觀分子量，適用于蛋白質(zhì)表達(dá)分析、純度鑒定等。
3.1 Native-PAGE
• 天然蛋白質(zhì)復(fù)合物的分離與分析：從組織勻漿或膜組分中一步分離具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
• 寡聚狀態(tài)及相互作用研究：確定蛋白質(zhì)的天然分子量、亞基組成及生理?xiàng)l件下的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。
• 功能活性檢測：電泳后直接進(jìn)行酶活性染色、配體結(jié)合分析等功能性實(shí)驗(yàn)。
• 結(jié)構(gòu)生物學(xué)樣品制備：從凝膠中回收天然蛋白質(zhì)復(fù)合物，用于二維結(jié)晶、負(fù)染電鏡等結(jié)構(gòu)解析前處理。
3.2 SDS-PAGE
• 分子量測定：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)亞基的表觀分子量。
• 蛋白質(zhì)表達(dá)分析：檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、誘導(dǎo)表達(dá)效果及樣品間差異。
• Western blot前處理：變性后的蛋白質(zhì)更易于與抗體結(jié)合，是免疫印跡實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)流程。
• 純度評估：監(jiān)測蛋白質(zhì)純化過程中各流份的純度和降解情況。
4.1 Native-PAGE
? 保留蛋白質(zhì)天然構(gòu)象與活性，可獲得功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息
? 支持電泳后直接進(jìn)行功能檢測，無需額外復(fù)性步驟
? 實(shí)驗(yàn)條件需優(yōu)化（如緩沖液pH、凝膠濃度、電極方向），操作復(fù)雜度較高
? 遷移行為受多重因素影響，無法直接推算分子量
4.2 SDS-PAGE
? 操作標(biāo)準(zhǔn)化程度高，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，適用范圍廣
? 分子量測定準(zhǔn)確，數(shù)據(jù)易于定量分析
? 樣品處理簡單（熱變性即可），適合高通量分析
? 蛋白質(zhì)完全變性，無法獲得天然構(gòu)象及功能相關(guān)信息
非變性電泳（Native-PAGE）操作全攻略
關(guān)鍵要點(diǎn)：
• 所有的預(yù)染蛋白Marker均為SDS-PAGE設(shè)計(jì)，不適用于非變性電泳。
• 非變性條件下，蛋白質(zhì)遷移受電荷、形狀和分子量共同影響，因此在單一凝膠濃度下，非變性蛋白Marker無法精確推算目標(biāo)蛋白的分子量。
• 如需確定非變性條件下蛋白質(zhì)的分子量，應(yīng)在不同凝膠濃度下測定蛋白質(zhì)的相對遷移率（Rf值），繪制凝膠濃度對Rf的曲線進(jìn)行推算。
• 非變性蛋白專用Marker為保持天然結(jié)構(gòu)，均未偶聯(lián)染料，電泳過程中不可見。如需檢測非變性蛋白Marker的轉(zhuǎn)膜效果，可使用麗春紅染色液，但需注意其靈敏度較低，可能無法顯示完整條帶。
推薦產(chǎn)品： MKPZ010 非變性蛋白 Marker (66-669 kDa)
關(guān)鍵要點(diǎn)：
• 必須使用非變性上樣緩沖液，確保不含SDS、DTT等變性劑。
• 嚴(yán)禁加熱樣品，室溫或冰上操作即可，避免熱誘導(dǎo)變性。
關(guān)鍵要點(diǎn)：
• 凝膠和電泳緩沖液中均不得添加SDS。
• 常規(guī)蛋白質(zhì)（pI 3-8）按常規(guī)方向電泳（向陽極遷移）；若目標(biāo)蛋白pI＞7（堿性蛋白），需反轉(zhuǎn)電極電泳，常規(guī)蛋白（pI＜7）按常規(guī)向陽極遷移；
• 電泳過程中產(chǎn)熱可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，建議在電泳槽外置冰浴降溫。
• 非變性條件下蛋白質(zhì)分子量較大，推薦使用5%-10%的凝膠濃度。
• 非變性蛋白質(zhì)荷質(zhì)比較低，泳動速度較慢，需適當(dāng)延長電泳時間。
關(guān)鍵要點(diǎn)：
• 轉(zhuǎn)膜緩沖液中的甲醇對蛋白質(zhì)有固定作用，非變性轉(zhuǎn)膜應(yīng)少加或不加甲醇。
• 以下轉(zhuǎn)膜條件為通用參考值，建議根據(jù)目標(biāo)蛋白特性進(jìn)行1-2次預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化：
• 膜孔徑選擇：>20 kD蛋白選用0.45 μm孔徑，≤20 kD蛋白選用0.22 μm孔徑。PVDF膜使用前需用無水甲醇潤濕活化。
只要抓住 “保留天然狀態(tài)” 這一核心，嚴(yán)格把控樣品、電泳、轉(zhuǎn)膜的每一個細(xì)節(jié)，避開變性雷區(qū)，非變性電泳也能輕松做好。
萬生昊天 GlassPAGE™ 和 PlusPAGE™ 預(yù)制膠系列產(chǎn)品本身不含SDS，通過選擇不同電泳緩沖液即可實(shí)現(xiàn)變性/非變性模式的自由切換，為您的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供更大靈活性。
Native-PAGE 與 SDS-PAGE：前者解析天然狀態(tài)，后者聚焦分子量信息。
明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康模x擇適配方法，方能獲得可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
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??你在實(shí)驗(yàn)中選擇Native-PAGE還是SDS-PAGE？主要研究什么類型的蛋白？
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