當細胞或組織被裂解時，內源性蛋白酶和磷酸酶便會釋放出來。一旦條件適宜，它們會迅速降解目標蛋白或其重要修飾狀態。

蛋白酶會水解蛋白質肽鍵，導致目標蛋白被切割，在WB中表現為條帶變弱、出現雜帶或完全消失；磷酸酶則會催化磷酸化蛋白的去磷酸化，使磷酸化蛋白無法被檢測。

因此，在蛋白提取過程中添加酶抑制劑，是維持蛋白質完整性與修飾狀態的關鍵，也是WB實驗成功的基礎。

酶抑制劑主要通過干擾酶的活性中心或結構，阻止其催化反應。根據其抑制的目標酶類型和具體的作用機制，可進行如下分類：

2.1 按抑制目標分類

蛋白酶抑制劑：用于防止蛋白質被降解。

磷酸酶抑制劑：用于維持蛋白質的磷酸化修飾狀態。

2.2 按作用機制分類

理解這一層次，有助于預測試劑的特異性、可逆性和使用條件。

2.2.1 蛋白酶抑制劑的作用機制

主要通過共價或非共價方式，作用于蛋白酶的活性位點。

   ● 不可逆抑制：抑制劑與酶活性中心的必需基團形成穩定的共價鍵，使酶永久失活。

例如：PMSF（苯甲基磺酰氟） 是一種不可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑。它特異性地與絲氨酸蛋白酶活性中心的絲氨酸羥基共價結合，使其永久失活。因其在水溶液中不穩定，需現用現加。

  ● 可逆抑制：抑制劑通過非共價鍵（如離子鍵、氫鍵）與酶結合，結合與解離處于動態平衡中。

       »競爭性抑制：抑制劑與底物結構相似，競爭結合酶的同一活性中心。

       »非競爭性抑制：抑制劑結合在酶活性中心以外的部位，通過改變酶構象來抑制活性。

例如：EDTA（乙二胺四乙酸） 是一種金屬離子螯合劑，屬于可逆的非競爭性抑制劑。它通過螯合金屬蛋白酶活性所必需的金屬離子（如Zn²?、Ca²?），間接抑制酶活性。因其作用依賴于螯合反應，在堿性（pH 8-9）條件下溶解和螯合效果更佳。

2.2.2 磷酸酶抑制劑的作用機制

主要模擬磷酸化反應的過渡態或產物，干擾去磷酸化過程。

  ● 競爭性抑制：抑制劑模擬磷酸化蛋白的磷酸基團，競爭性地占據磷酸酶的活性中心。

例如：正釩酸鈉（Sodium Orthovanadate） 在活化后形成原釩酸鹽，其結構與磷酸鹽的過渡態類似，可競爭性抑制酪氨酸磷酸酶和堿性磷酸酶。

  ● 非競爭性/不可逆抑制：抑制劑與酶活性中心的必需組分結合，導致酶失活。

例如：氟化鈉（Sodium Fluoride） 可與磷酸酶活性中心的鎂離子形成難溶的氟磷酸鎂復合物，非競爭性且不可逆地抑制酸性磷酸酶的活性。

2.3 常用抑制劑速查表

競爭性抑制劑的效果取決于其與底物的濃度比，增加底物濃度可降低抑制效果。

不可逆抑制劑一旦起作用，效果是持久的，稀釋不能恢復酶活。

在實際應用中，由于裂解液中蛋白酶/磷酸酶種類復雜，推薦使用廣譜的復合抑制劑混合物，以提供全面保護。

面對多種抑制劑，考慮實驗需求，合理選擇是關鍵：

1. 是否檢測蛋白磷酸化：若僅檢測總蛋白，添加蛋白酶抑制劑即可；若需檢測蛋白磷酸化，則必須同時添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑。

2. 使用蛋白酶抑制劑混合液：由于不同蛋白酶對抑制劑的不同，且細胞或組織中存在的蛋白酶類型多樣，使用復合型蛋白酶抑制劑混合物通常是更有效、更便捷的選擇，它們能提供更廣泛的保護。

3. 注意抑制劑的溶解性和穩定性：許多抑制劑水溶性差或在水中不穩定。例如PMSF在水溶液中半衰期很短，需在裂解前新鮮加入。應嚴格按照產品說明配制和保存。

4. 考慮下游應用：如果后續實驗涉及金屬螯合親和層析，應使用不含EDTA的蛋白酶抑制劑混合物。

1. 提前加入：酶抑制劑應在裂解前加入至裂解液中，確保在細胞或組織裂解的第一時間就起效。

2. 低溫操作：整個蛋白提取過程應在低溫環境下進行，進一步降低酶活性。

3. 新鮮配制：對水溶液中不穩定的抑制劑（如PMSF），必須保證每次實驗都新鮮添加。

4. 避免反復凍融：商品化的抑制劑混合物儲存液應分裝保存，避免反復凍融導致活性降低。

5. 正確保存：嚴格按照產品說明書的要求保存抑制劑，如片劑抑制劑通?？稍?℃保存，而溶液型抑制劑往往需要-20℃保存。