周細胞怎么分離？找遍了百度也沒有看到具體的protocol，不要急，看看我們技術(shù)整理的實踐經(jīng)驗吧。
不用急，先把參考的文獻步驟截個圖
那么我們就進入正題吧
一.組織的處理
1.確保所有液體、容器、儀器和專用操作區(qū)域都是無菌的。
2.將組織樣本（由組織庫或手術(shù)團隊采購）放入由冷凍的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的含20%胎牛血清（FBS）和2%青霉素-鏈霉素（P/S）冰上操作
3.從培養(yǎng)基中取出樣品，并用由磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）組成的洗滌介質(zhì)洗滌，補充2%FBS和2%P/S。處理樣品時，使用細尖鑷子夾住大血管盡量減少對組織的擠壓。
4.將樣品浸泡在培養(yǎng)皿中的洗滌介質(zhì)中，用消毒虹膜剪刀去除其他大血管和結(jié)締組織
5.使用單側(cè)剃須刀片或一把鋒利的虹膜剪刀將剩余的組織切成約1 mm3的小塊。
備注：如果立即處理樣品，將獲得最高的細胞產(chǎn)量。如果延遲是不可避免的，則將處理后的組織存儲在新鮮存儲介質(zhì)（>5 ml/1 cm3組織）在4°C下持續(xù)72小時或者使用組織凍存液凍存一個月也能提取出來周細胞，但可能影響細胞產(chǎn)量。
二. 組織的消化和細胞的分離
1. 配制好消化溶液，使用DMEM配制各包含0.5mg/ml膠原酶I、膠原酶II和膠原酶IV，并在水浴中加熱至37°C。
2使用眼科剪刀剪碎組織，盡量剪碎
3.通過100µm的濾網(wǎng)過濾懸浮的組織塊，并用PBS洗滌兩次。將組織塊轉(zhuǎn)移到30 ml無菌容器中蓋子密封嚴密。
注意：短而寬的罐子比高而窄的管子效果更好。或者，將紙巾片裹在50毫升無菌試管外，石蠟封口后平置。
4.加入所有消化溶液（總計4.5 ml），并將容器放置在37°C、轉(zhuǎn)速設(shè)定為120 rpm的搖動水浴中的密封塑料袋中，或者，用石蠟?zāi)っ芊馊萜鳎⑵浞湃朐O(shè)定為120rpm的加熱軌道振蕩器中。
5.15分鐘后，取出并倒置離心管三次，然后再震蕩15分鐘。吸出膠原酶，補充有5-10mlFBS和1%P/S。
6.用10毫升血清學(xué)移液管輕輕吹打10到20次，直至組織絮狀化后置于過濾懸架上依次通過100µm、70µm和最后40µm的細胞過濾器，以去除未消化的組織，獲得單細胞懸浮液。
注意：不要在細胞濾網(wǎng)之間沖洗，以免酶消化過程中產(chǎn)生細胞碎屑。
7.將細胞懸浮液以200 x g離心4分鐘，小心傾倒上清液，并將沉淀重新懸浮在1 ml紅細胞裂解緩沖液中在室溫下保持2分鐘，然后用4毫升PBS稀釋。
8.重復(fù)離心步驟，并將細胞重新懸浮在1mlPBS中。充分混合，取10µl細胞懸浮液進行細胞培養(yǎng)并計數(shù)。
9.將10µl細胞懸浮液與10µl臺盼藍染色劑混合，并將10µl混合物放在標準血細胞儀上進行細胞計數(shù)。
10.計算四個角落正方形（每個正方形細分為十六個小正方形）中明亮的圓形單元格的數(shù)量，除以4得到每個角平方的平均值。將平均值乘以2以說明染色稀釋因子，然后每1ml樣品乘以10^4便是獲得細胞總數(shù)。
二. 細胞培養(yǎng)：
準備好培養(yǎng)瓶，初代建議使用T25瓶培養(yǎng)，為了獲得更多的細胞 ，細胞鋪板前建議使用細胞包被液給培養(yǎng)瓶進行包被,（啟達生物：SD0044)培養(yǎng)箱包被15-20分鐘后，使用PBS沖洗兩次后待用
準備好周細胞專用培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基包含周細胞生長因子和抑制成纖維和內(nèi)皮細胞生長的小分子化合物 ，以促進周細胞生長更加純化，培養(yǎng)瓶加入2ml左右的PGM周細胞培養(yǎng)基（啟達生物:P4001)，
細胞離心后用周細胞培養(yǎng)基重懸，初次鋪板每個T25瓶不低于60萬以上的細胞量進行鋪板 ，48小時后換液 ，去除死細胞，
后期使用PGM培養(yǎng)基按照正常細胞操作換液或者傳代即可。
腦周細胞48h的生長圖
腦周細胞72h的生長圖
并不是所有的周細胞都使用這個操作方法哦 ，針對不同的周細胞，可能有更加優(yōu)化的提取方法，來看看下面各組織的使用的方法吧，
一、 腦
可以使用酶消化和外植體培養(yǎng)從白質(zhì)和灰質(zhì)中分離腦周細胞（92107120-122）。它們表達PDGFRβ、αSMA、CD13、NG2、CD146和結(jié)蛋白（121）。可在PGM培養(yǎng)基中保持15-20倍增。
二、 心
使用酶消化、過濾和免疫磁分離從心房和心室中分離心臟周細胞，以獲得CD31–/CD34+細胞（21，32，55）。心臟周細胞可在PGM培養(yǎng)基中保持25倍增
三、骨骼肌
骨骼肌來源的周細胞主要通過外植體培養(yǎng)分離。不同的群體，如堿性磷酸酶/CD56–細胞和CD146+/NG2+/αSMA+/CD45–/CD31–/CD34–細胞，可以通過FACS或免疫磁性微珠純化（77，78，93123124）。此周細胞極容易脫落 ，建議使用toprocult基質(zhì)膠(啟達生物：SD0058)稀釋25倍包被，包被后使用PGM可達15倍以上擴增
四、骨髓
骨髓周細胞可以使用微珠細胞分選策略進行免疫磁性分離。骨髓樣品用Ficoll Histopaque 1077處理以獲得單核細胞。首先，從CD45+/CD34+級分中陰性純化細胞群。然后，選擇CD146+細胞并進一步擴增，通過流式細胞術(shù)和免疫細胞化學(xué)最終確認CD45–/CD34–/CD146+組合的純度（105）。
五、腎
腎周細胞在調(diào)節(jié)通透性、肌成纖維細胞的形成、血管生成和腎髓質(zhì)血流量方面至關(guān)重要（126-128）。在使用膠原酶混合物（IA、II和IV）進行組織消化后，對細胞進行FAC分選，以獲得CD146+/CD34–/CD45–/CD56–周細胞群，其也表達經(jīng)典的制造商PDGFRβ和NG2。傳代時需使用細胞包被液（啟達生物：SD0044）上進行培養(yǎng)擴增。
六、 肺
分離人肺周細胞的方法包括酶消化、磁性微球分選和FACS選擇（109130-132）。然后，對細胞進行分選以收集CD45–/CD31–/CD326–/PDGFRβ+部分（109130）。此外，Kramann等人使用含有AY16（一種抗Trop2單克隆抗體）-DT3C綴合物的選擇培養(yǎng)基分離肺周細胞，以消除上皮干細胞和內(nèi)皮細胞（131）。經(jīng)修飾的培養(yǎng)基篩選的細胞表達PDGFRβ和硫酸軟骨素蛋白多糖4（CSPG4）。
七、皮膚
已經(jīng)從新生兒包皮或成年女性乳房皮膚中分離出周細胞（133）。在用II型膠原酶或dispase消化后，通過FACS或免疫磁性微珠對VLA-1bri/CD45群體進行分類（112133135）。此外，皮膚周細胞表達人高分子量黑色素瘤相關(guān)抗原（HMW-MAA）、PDGFRβ、結(jié)蛋白、αSMA、α1β1-整合素、α-和γ-肌動蛋白亞型以及肌球蛋白（136）。
八、臍帶
人臍帶周細胞可以通過酶消化和外植體培養(yǎng)分離（31）。Helmbold等人使用CD146綴合的微珠對細胞進行免疫磁性分選，以分離CD146+群體（137）。Cathery等人通過外植體培養(yǎng)分離周細胞。對遷移的細胞進行免疫磁性分選，獲得CD31/NG2+群體（31）。所有分離的群體均表現(xiàn)出CD34的特征性陰性表達，CD146和NG2的陽性表達。使用PGM周細胞培養(yǎng)基，細胞可達20倍增以上。
九、 視網(wǎng)膜
從色素層分離后，通過酶解分離人視網(wǎng)膜周細胞。將細胞接種在明膠預(yù)涂層的培養(yǎng)皿上，并與含有FBS的DMEM/F-12一起培養(yǎng)。通過NG2、αSMA、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白和細胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白的免疫熒光染色來鑒定視網(wǎng)膜周細胞的特征形態(tài).
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