同一類的Ig，根據其鉸鏈區氨基酸組成和重鏈二硫鍵的數量及位置的不同，又分為不同的亞類（subclass），如人IgG可分為四個亞類，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。輕鏈可分為兩種，分別為kappa（κ）鏈和lambda（λ）鏈。據此，可將Ig分為兩型（type），即κ型和λ型。

Fig.1 抗體結構示意圖

隨著抗體藥物技術的不斷演進，抗體類型與分子結構日趨多樣化。

從傳統單抗（mAb）到雙抗（BsAb）、抗體偶聯藥物（ADC）、抗體寡核苷酸偶聯體（AOC）及多價抗體等新分子形式層出不窮。

這些分子在 Fc 結構、親和力、糖基化修飾及熱穩定性 等方面存在顯著差異，
導致下游純化環節面臨新的挑戰：

• Protein A 結合差異增大：部分抗體或片段無法穩定結合；

• 分子穩定性更敏感：低 pH 洗脫易引發構象變化或聚集；

• 雜質性質更接近：片段、聚集體及錯配體在電荷、疏水性上與主峰相似，分離難度顯著增加；

• 工藝窗口更窄：對配基選擇、洗脫條件及清洗策略提出更高要求。

因此，開發兼顧高選擇性、溫和洗脫條件的親和層析工藝，成為抗體純化工藝優化的關鍵方向。

抗體親和層析的原理

抗體親和層析（Antibody Affinity Chromatography）是利用生物分子間特異性相互作用實現高選擇性分離的經典方法。
最常用的配基為 Protein A——源自金黃色葡萄球菌的膜蛋白，可與抗體 Fc 區特異性結合，實現一步捕獲與高純化。
天然 Protein A 含五個 IgG 結合域，但也具有非特異結合片段，現代填料多采用基因改造型 Protein A，保留 Fc 結合功能的同時，顯著降低非特異吸附并增強其耐堿性。
此外，對于 Fab、IgM、抗體片段 等特殊分子，還可使用 Protein L（結合 κ 鏈）或 IgM 親和填料 進行特異分離。

核心原理：利用抗體與配基的高親和結合 → 非目標雜質洗脫 → 調整 pH 實現可逆洗脫。

親和填料選擇的關鍵要素

選擇合適的親和填料，是抗體純化工藝開發與產業化放大的核心環節。
優秀的填料不僅要具備良好的分離性能，還需兼顧放大可行性、長期穩定性與供應可靠性。

1.配基類型與結合特異性

不同親和配基識別的抗體結構位點不同，合適配基的選擇是實現高選擇性捕獲的基礎。

• Protein A：與抗體的 Fc 區結合，適用于 IgG1、IgG2、IgG4 及多數 Fc 融合蛋白，是當前最主流的抗體捕獲配基；

• Protein L：識別 κ 輕鏈區域，適用于無 Fc 結構的抗體片段（如 Fab、scFv）或Fc改造后的抗體及部分 IgA、IgM；

• Protein G：結合范圍更廣，可作為 Protein A 的補充，用于特殊亞型或部分Fab的結合；

• IgM ：識別多聚結構域，能在高分子量條件下保持高選擇性分離。

不同抗體類型（IgG、IgM、IgA、雙抗、抗體片段等）需根據結合結構、亞型及分子特性匹配合適配基，才能獲得最佳純度與回收率。

下圖展示了抗體親和填料選擇流程圖（Fig.2），可幫助研發人員在早期開發階段快速判斷適用填料類型與推薦產品：

Fig.2 抗體親和填料選擇流程圖

2.動態結合載量（DBC）與分離平衡

DBC（Dynamic Binding Capacity）反映填料在特定流速與保留時間下的結合能力，是評價抗體捕獲效率的重要指標。

• DBC 高 → 捕獲通量提升、處理能力強，但可能導致分辨率下降或雜質共洗脫；

• DBC 低 → 分離效果好但通量不足。

工藝開發中需在載量、流速、收率與純度之間找到平衡點，綜合考慮分離效率與工藝的經濟性。

3.可放大性與壓力–流速性能

可放大性是衡量填料從實驗室到生產規模平穩過渡能力的關鍵。
部分填料在小試階段表現良好，但放大后因機械強度不足或柱床壓縮，出現運行壓力上升、流速受限、柱床塌陷等問題，迫使客戶在中后期調整工藝或降低生產效率。
建議在早期開發階段就驗證填料的壓力–流速表現與可用線速度窗口，確保放大后依然滿足通量與運行壓力要求。

4.長期耐堿穩定性

親和層析需經受反復NaOH在位清洗（CIP），耐堿性能直接決定填料使用壽命與生產成本。
高耐堿性填料可承受 0.5–1.0 M NaOH 清洗數百循環而保持載量與性能穩定，是實現長期穩定生產的關鍵。

5.批間一致性與供應穩定性

在工業化階段，層析填料不僅是純化工藝的關鍵耗材，更是保證生產穩定、可控的重要組成部分。

填料的質量批間一致性和穩定供應直接影響工藝的穩健運行與用戶終產品質量的一致性。

• 批間一致性：考察不同批次填料在關鍵性能等方面保持穩定，以確保純化工藝在不同生產周期中具備良好的重復性和產品質量一致性。若批次差異過大，可能導致目標蛋白回收率波動、雜質譜變化或放大驗證失敗。

• 供應穩定性：考察方向應不僅包含供應商持續、可靠的供貨能力，還應包括供應商在質量管理體系、生產產能、工藝一致性驗證及技術支持等方面的長期穩定性。對于商業化生產企業而言，供應鏈的穩定與可持續性是維持生產穩定運行和風險可控的前提條件。

在親和填料篩選階段，應將產品的批間一致性與供應商的長期穩定供貨能力納入綜合考量。

這不僅關系到物料性能的可重復性，也決定了工藝的穩健性和最終產品的質量穩定性。

應用案例：Novo-A Diamond 的溫和洗脫表現

在抗體純化中，低 pH 洗脫可能引起抗體構象變化和聚集。
使用 Novo-A Diamond 在 pH 4.0 條件下即可完全洗脫，純度 >94%，回收率 >95%，載量約 65 mg/mL（Fig.3）。

實驗條件：

層析柱：EzScreen 4.4 mL（Bed height = 10 cm）
樣品：mAb 原樣，樣品濃度6.8 mg/mL
Binding buffer: 20mM Tris-HCl, 0.15M NaCl, pH 7.2

Wash buffer 1: 20mM NaAc，1 M NaCl, pH 7.2

Wash buffer 2: 20mM Tris-HCl, pH 7.2

Elution buffer 1: 50mM NaAc-HAc, pH 4.0

Elution buffer 2: 50mM NaAc-HAc, pH 3.5

Fig.3 Novo-A Diamond單抗純化層析及電泳圖譜

結果表明：Novo-A Diamond 在溫和洗脫條件下仍具高捕獲能力，適合對低pH條件敏感抗體的純化。

總結

抗體親和層析是單抗及其衍生分子下游純化的關鍵環節，理想的親和填料應在 分離性能（DBC 與純度）、放大適配性（壓力–流速與耐堿性） 及供應保障（批間一致性與供應商能力）之間實現平衡。
在早期工藝開發階段充分評估這些維度，可有效避免后期因流速受限、配基衰減或供貨波動引起的工藝變更與驗證風險。

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