疏水作用層析（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC） 是蛋白質純化技術體系中極具價值的一種分離手段。早在 1948 年，Tiselius 就提出了利用疏水相互作用進行分離的概念。與依賴分子電荷差異的離子交換層析不同，疏水層析利用蛋白質表面疏水結構差異實現分離——在高鹽環境中，疏水基團之間的相互作用被增強，從而促進蛋白質與填料表面的結合。
在重組蛋白生產中，宿主細胞蛋白等雜質通常親水性更強，而目標蛋白可能含有天然疏水結構域（如抗體的恒定區）。這種物性差異賦予疏水層析在去除特定雜質方面的天然優勢。更重要的是，HIC 在工藝流程中的應用十分靈活——既可在高鹽條件下作為捕獲步驟，也可在中鹽條件下作為中度純化，也常用于在緩沖液條件稍作調整后與離子交換層析組合，實現精純目的。
疏水作用層析的基本純化模式
疏水作用層析常見的操作模式包括結合–洗脫模式和流穿模式。
• 結合–洗脫模式：工藝步驟通常包括平衡、上樣、清洗、洗脫和再生。一般在高鹽條件下將樣品上柱，高鹽環境可增強蛋白質表面疏水基團與填料的相互作用，使目標分子結合在介質上。上樣及清洗后，通過逐步降低洗脫液中的鹽濃度，依結合力強弱依次洗脫不同分子，從而實現分離純化。
• 流穿模式：選擇疏水性較強的填料，并在上樣時不添加鹽或僅添加低濃度鹽，使目標蛋白與填料幾乎不發生疏水作用，直接流出，而疏水性較強的雜質被填料保留，實現雜質去除。
疏水填料配基種類及其強弱應用介紹
Table 1. 疏水填料強弱應用介紹
疏水層析介質疏水性強弱對比表
注：填料的疏水性不僅取決于配基種類，還會受到配基密度及基質性質等因素的影響，從而改變其實際疏水強度。
重組蛋白純化中使用疏水作用層析（HIC）的核心優勢
獨特機制帶來的選擇性
• 基于疏水表面差異的分離：在高鹽（如 1.0~2.0M硫酸銨等鹽）條件下，疏水基團的溶劑化被削弱，蛋白更傾向與填料的疏水配基（苯基、丁基、辛基等）發生可逆結合；隨后通過降低鹽濃度（或加入溫和添加劑）使蛋白依結合強弱順序洗脫。
• 可有效區分電荷相近但疏水性不同的分子：（例如與目標蛋白等電點接近的 HCP）。這點與依賴電荷差異的離子交換形成互補。
• 溫和洗脫，保留活性：通過降鹽梯度洗脫，無需極端pH或高比例有機相（對比：RPC需高濃度有機試劑），最大限度保留蛋白天然構象和生物活性。
關鍵應用優勢
• 特定雜質的高效去除
○ 宿主蛋白（HCP）：疏水性較強者在高鹽下結合更緊，可被選擇性去除。
○ 聚集體：因疏水表面積更大，優先被吸附，洗脫晚于單體，有助于樣品聚體含量控制。
○ 內毒素與核酸：在合適鹽種類與緩沖條件下，HIC可一定程度降低其共洗脫，但通常需與AEX流穿/TFF聯合使用以達到去除標準。
• 良好的工藝銜接與通量
○ 與離子交換/鹽析無縫銜接：高鹽樣品或經硫酸銨沉淀處理后的樣品，可在調至目標鹽濃度且樣品澄清（0.22μm過濾）的前提下直接上柱，減少脫鹽/換液環節（是否免TFF視黏度/導電度窗口而定）。
○ 高通量友好：高剛性疏水填料（如Diamond Phenyl）具有良好的機械強度，可在較高線速度下運行，并可通過多柱切換/并聯提升產能與設備利用率。
應用案例介紹
案例一：某重組疫苗疏水步驟純化
• 介質：Diamond Butyl Mustang
• 樣品：經復合模式層析捕獲洗脫后樣品
• 流動相1：高鹽Buffer，pH7.0
• 流動相2：低鹽Buffer，pH7.0
• 再生：超純水
Fig.1 某重組疫苗疏水步驟純化層析及電泳圖
實驗結果
疏水層析后SEC純度提高3%以上。
案例二：某重組蛋白疏水層析純化
• 層析柱：BXK16/20 10cm bed height, CV=20mL
• 介質：Phenyl Bestrose 6 Fast Flow (high sub)
• 樣品：酵母培養上清，加入0.5M硫酸銨
• 樣品體積：450ml (22.5 c.v.)
• 流速：300cm/h (loading) 60cm/h (elution)
Fig.2 某重組蛋白疏水純化層析圖譜
案例三：某重組蛋白疏水層析應用
• 介質：Phenyl Bestrose 6 Fast Flow (high sub)
• 樣品： 用0.22μm濾膜過濾后
• 流動相1：高鹽Buffer pH7.2
• 流動相2：低鹽Buffer pH7.2
Fig.3 某重組蛋白疏水步驟純化層析及電泳圖
HIC技術參數優化關鍵點
配基選擇
• 短鏈烷基配基（丁基、丁硫基等）：
疏水性較弱，適合疏水性較強或穩定性較差的蛋白，避免結合過強導致洗脫困難或活性下降。
• 長鏈烷基配基（辛基等）：疏水性中等偏強，適合疏水性中等的蛋白，通過增強結合力提高分離效率。
• 芳香族配基（苯基等）：疏水性最強，除疏水作用外，還可能參與π–π相互作用，對疏水性較弱、易流穿的蛋白尤其有效。
鹽的種類與濃度
• 促結合鹽選擇（Hofmeister 序列由強到弱）：硫酸銨 > 硫酸鈉 > 氯化鈉
• 常用濃度：
○ 上樣/平衡：1.0~1.5M硫酸銨（部分工藝可用至2.0M增強結合）。
○ 洗脫：線性降鹽或階梯降鹽濃度至接近0M。
注意：鹽濃度過高會增加溶液黏度、提升運行壓力，并在進柱端引發沉淀風險。
PH控制
• 建議范圍 pH 6–8：保持蛋白構象穩定，減少極端pH對配基和基質的化學損傷。
• 對于構象敏感或易聚集的蛋白，可在洗脫緩沖液中添加溫和助溶劑（如甘油、乙二醇）提高穩定性。
小結
疏水作用層析憑借高選擇性、溫和洗脫條件、特定雜質的高效清除能力，已成為重組蛋白純化流程中不可替代的單元操作。
典型應用場景包括：
1. 對活性保持要求高且能耐受高鹽條件的酶、抗體等分子。
2. 電荷性質與雜質接近、難以通過IEX區分的蛋白。
3. 需要高效去除聚集體、疏水性HCP的工藝。
4. 鹽析或高鹽預處理后直接捕獲目標蛋白。
通過合理選擇配基、精確設定鹽種類與梯度，結合pH等條件優化，并與AEX/TFF等單元操作協同設計，能在重組蛋白工藝中實現更穩健的純度與回收率平衡。
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