圖5. 四環素誘導型tetO-Cre（Hyeonhui Kim, et al., Lab Anim Res. 2018）
樞密科技可提供Cre-loxP重組酶系統的載體構建服務及病毒包裝服務。
參考文獻：
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2. 孔維健, 常宇鑫, 昝春芳, 鄭爽, 楊小玉. 基于Cre-loxP系統條件性基因敲除小鼠的構建及其應用進展. 中國實驗診斷學. 2017; 21（12）:2208-2211.
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Cre-LoxP重組酶系統載體構建服務
Cre-LoxP系統
Cre-Loxp系統策略是進行基因組定點突變的新途徑，可在DNA的特定位點上執行敲除、插入、激活、倒轉及易位等。該系統在80年代被引入后，已被成功的應用于酵母菌、植物、哺乳動物細胞培養及小鼠身上。Cre-LoxP系統包括Cre重組酶和Loxp位點兩個部分。
Cre重組酶是整合酶家族的一員，1981年從大腸桿菌噬菌體P1中發現，是最常用的位點特異性DNA重組酶。Cre基因有1029個堿基，Cre重組酶由343個氨基酸組成（約38kD），它不僅具有催化活性，而且跟限制酶相似，識別特異的DN A序列，如：loxP位點，引起重組。Cre重組酶有70% 的重組效率，不借助任何輔助因子，可作用于多種結構的DNA底物，如線形、環狀甚至超螺旋DNA。
loxP位點是Cre重組酶作用的特異性重組位點，兩個13 bp的反向重復序列和8 bp的間隔序列構成，長34 bp，具體序列如下：5’一ATAACTTCGTATA一GCATACAT一TATACGAAGTTAT一3’ / 3’一TATTGAAGCATAT 一CGTATGTA一ATATGCTTCAATA一5’。 兩個反向重復序列是Cre的識別序列，中間的間隔序列是重組發生的位置，同時也決定了loxP位點的方向，根據loxP序列的排列方向產生不同的重組結果。
圖1. Cre重組酶結合loxP的位點
Cre-loxP系統的原理
Cre-loxP系統存在以下幾種誘導重組的方式，這是基于Cre重組酶與loxP位點的相互作用而實現的。當基因內存在loxP位點且有Cre重組酶存在時，Cre重組酶便會與loxP位點兩端的反向重復序列區結合形成二聚體。此二聚體與其他loxP位點的二聚體結合，進而形成四聚體。隨之，loxP位點之間的DNA序列被Cre重組酶切掉，切口通過DNA連接酶重新連接。DNA重組結果主要取決于loxP位點的方向及位置。
Cre重組酶介導的兩個loxP序列間的特異性重組根據序列位置和方向的不同分為三種 情況：①當兩個loxP序列位于同一條DNA鏈且方向相同時Cre重組酶能夠敲除兩個loxP序列間的DNA片段；②當兩個loxP序列位于同一條DNA鏈且方向相反時，Cre重組酶能夠反轉兩個loxP序列間的DNA片段；③當兩個loxP序列位于不同DNA鏈上時，Cre重組酶能夠介導loxP序列間DNA鏈的交換或染色體易位。Cre重組酶介導兩個LoxP位點間的重組是一個動態、可逆的過程。
圖2. Cre-loxP系統誘導重組的方式
Cre-loxP系統的優點
1. 高效性；
Cre重組酶與具有loxP位點的DNA片段形成復合物之后，可以快速引發DNA重組，不受靶基因大小和位置的影響。
2. 時空特異性；
可以特定時間實現體內特定種類器官或組織中的基因敲除，避免了某些基因完全敲除所導致的胚胎致死效應。
3. 應用范圍廣。
真核及原核均適用，不同組織、不同生理條件下均可起作用。
Cre-loxP系統的應用
一、條件性基因敲除小鼠的構建
1. 轉基因動物依賴的基因敲除
一般應用Cre-loxP系統進行基因操作時較為常見的形式是兩種轉基因動物進行雜交。方法為：
（1） 利用原核注射的方法獲得轉基因“Cre小鼠”。在Cre基因上游加入特異性啟動子，利用啟動子控制Cre重組酶的表達；
（2） 在胚胎干細胞（ES）中通過置換型載體進行同源重組，向基因組靶位點引入選擇標記基因，并在其兩側引入兩個同向排列的Loxp位點。兩條同源染色體都帶有 Loxp位點且引入的Loxp位點不能干擾靶基因的轉錄。將該ES細胞打入假孕母鼠中，發育成“floxed小鼠”；
（3） “Cre小鼠”和“floxed小鼠”交配，Cre重組酶會在特定組織細胞表達，并切掉Loxp位點之間的靶基因和1個Loxp位點，從而達到靶基因的失活或敲除。
轉基因動物的缺點：（1）實驗周期長，成本高；
（2）區域特異性不高。
圖3. 使用cre-loxp系統獲得組織/細胞特異性基因敲除小鼠（Kesha Rana, et al., Asian J Androl, 2014）
1. 病毒依賴的基因敲除
由于轉基因動物的諸多缺點，現如今越來越多的科研工作者選擇新的方式來構建條件性基因敲除小鼠，即病毒依賴的Cre-loxP重組系統，方法為：
（1） 通過轉基因動物辦法獲得“Cre小鼠”或“floxed小鼠”；
（2） 注射Cre病毒進loxP轉基因小鼠體內，或者注射loxP病毒到Cre轉基因小鼠體內，引入Cre或loxP元件。
病毒依賴的基因敲除的優點：（1）實驗周期短，成本小；
（2）區域特異性高。
二、基因插入
采用同源重組技術，在基因組上人工構建兩個Loxp 位點，借助構建的兩個Loxp 位點，把兩端帶有Loxp 位點的外源基因重組到基因組上，此種重組是雙向的，既可以把外源基因重組到小鼠基因組內，也可把小鼠基因組內源基因重組出來，這是定點整合的重要手段之一。
三、基因激活
利用Cre/Loxp系統不僅可對基因進行敲除，還可對基因進行特定激活，了解基因的正向效應。在兩個同向Loxp位點之間加入終止信號，Loxp位點后加入靶基因，與Cre小鼠交配后，Cre重組酶切除終止信號及1個Loxp位點，其Loxp位點后面的靶基因便被“激活”表達。
四、基因倒轉、易位等
Cre-loxP系統的新進展
1. 對Cre元件的改造：在Cre元件的C端接上雌激素受體（ER）的配體結合結構域，為了避免體內雌激素的干擾，可對雌激素受體的配體結合區做一定程度的改變，使其只能和某些雌激素衍生物相結合。目前使用最多的是Cre-ERT2突變體，融合蛋白Cre-ERT2不能入核，定位在胞漿內，當雌激素衍生物tamoxifen結合到Cre-ERT2受體結合結構域后，蛋白才會通過構象變化從錨定蛋白HSP90上解離下來，進入細胞核，識別loxP位點并發生重組。通過控制tamoxifen的注射時間，就可以調控基因重組的時間特異性。
圖4. 他莫昔芬誘導的Cre-ER系統（Hyeonhui Kim, et al., Lab Anim Res. 2018）
1. 對loxP元件的改造：loxP元件也可以在間隔區和回文序列進行突變，不同的堿基選擇就造就了不同的lox位點，常見的有 lox2272、lox511、lox5171、loxN和loxP等。突變后的loxP序列和同樣突變的loxP序列匹配，才能被Cre重組酶識別和重組，而不能和未突變的loxP序列匹配，這樣就可以將不同的loxP序列組合用于控制多個基因，在Cre重組酶的作用下，實現多個基因的重組。Brainbow技術就是根據loxP序列的改造而實現的。
2. 四環素誘導型tetO-Cre：將四環素調控系統與Cre-loxP系統相結合，需要用兩種轉基因小鼠交配使用。一種是由四環素響應啟動子元件（TRE, 也叫 tetO）控制的Cre工具鼠（TRE-Cre, 也叫tetO-Cre）；另一種是由組織特異性啟動子驅動的表達四環