本土新冠病例病毒變異監(jiān)測(cè)情況
據(jù)中疾控全國(guó)新型冠狀病毒感染疫情情況（2024年12月）的報(bào)告，2024年12月1日-12月31日，全國(guó)31個(gè)省（自治區(qū)、直轄市）及新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)發(fā)熱門診（診室）診療量波動(dòng)上升。從12月13日的8.1萬(wàn)波動(dòng)上升至12月30日的12.8萬(wàn)（本月最高）。
2024年第49周（12月2日-12月8日）至第52周（12月23日-12月29日），全國(guó)哨點(diǎn)醫(yī)院流感樣病例占門（急）診就診人數(shù)比例逐漸升高，其中流感病毒陽(yáng)性率為28.7%，新冠病毒陽(yáng)性率為1.2%（圖1）。
圖1. 全國(guó)哨點(diǎn)醫(yī)院流感樣病例新冠和流感病毒陽(yáng)性率變化趨勢(shì)
2024年12月1日-12月31日，全國(guó)31個(gè)省（自治區(qū)、直轄市）及新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)共報(bào)送3836例本土病例新冠病毒基因組有效序列，均為奧密克戎變異株。主要流行株為XDV系列變異株和JN.1系列變異株。根據(jù)采樣日期，第49周（12月2日-12月8日）至第52周（12月23日-12月29日）JN.1及其亞分支占比分別為31.5%、30.3%、35.9%、37.6%，XDV及其亞分支占比分別為62.3%、64.3%、59.7%、59.1%（圖2）。
圖2. 全國(guó)新冠病毒感染本土病例變異株變化趨勢(shì)
DIFF新冠體外藥效評(píng)價(jià)
迪福潤(rùn)絲生物采用自主研發(fā)的蛋白酶抑制劑篩選系統(tǒng)來(lái)發(fā)現(xiàn)新的抗新冠化合物，不僅能進(jìn)行初步的藥物篩選，還能定量分析候選藥物的劑量-反應(yīng)關(guān)系，計(jì)算IC50。以新冠病毒（3CL）的主要蛋白酶為例，下圖比較了使用活病毒檢測(cè)方法和DIFF的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)同一種 COVID-19蛋白酶抑制劑的結(jié)果。作為抗病毒藥物的候選者，GC376通過(guò)抑制病毒復(fù)制所需的關(guān)鍵蛋白酶發(fā)揮作用。案例表明，兩種檢測(cè)方法得出的IC50值非常接近（圖3），這證實(shí)了我們所設(shè)計(jì)的系統(tǒng)在模擬真實(shí)病毒感染環(huán)境以評(píng)估藥物療效方面的可靠性。
圖3. 蛋白酶抑制劑篩選系統(tǒng)IC50測(cè)定結(jié)果與真病毒檢測(cè)結(jié)果對(duì)比
圖4. 蛋白酶抑制劑篩選系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度與有效藥物濃度呈正相關(guān)
迪福潤(rùn)絲專利蛋白酶抑制劑檢測(cè)系統(tǒng)是基于綠色熒光蛋白（GFP）衍生蛋白的熒光報(bào)告技術(shù)。此系統(tǒng)的核心特點(diǎn)在于，只有在抑制劑有效作用于目標(biāo)蛋白時(shí)，衍生蛋白才會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)。隨著抑制劑作用的增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度正向增加。上圖展示了通過(guò)肉眼直接觀察熒光變化的能力（圖4）。在對(duì)照樣本（DMSO處理組）中，無(wú)法看到綠色熒光（僅為背景值）。當(dāng)GC376的濃度為1μM時(shí)，可見到微弱的綠色熒光，這表明有限的活性。然而，當(dāng)GC376濃度增至10μM時(shí)，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，說(shuō)明藥物作用導(dǎo)致的熒光標(biāo)記增多。這種肉眼可見的熒光變化直觀地顯示了藥物效應(yīng)的劑量依賴性。
DIFF新冠體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)
1）攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)
迪福潤(rùn)絲生物采用自主構(gòu)建的VSV載體新冠假病毒進(jìn)行疾病動(dòng)物模型研究（組圖5）。由于假病毒與天然病毒的相似性，DIFF新冠假病毒可用來(lái)進(jìn)行模擬感染實(shí)驗(yàn)，與新冠病毒SARS-CoV-2感染動(dòng)物模型結(jié)果相似，結(jié)果可靠且重復(fù)性高（表1）。
表1 DIFF新冠假病毒與SARS-Cov-2病毒模擬攻毒實(shí)驗(yàn)對(duì)比
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實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目類型 |
DIFF新冠假病毒 |
新冠(SARS-Cov-2)病毒 |
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實(shí)驗(yàn)室等級(jí)要求 |
BSL-2級(jí) |
BSL-3級(jí) |
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預(yù)約周期 |
1-2周 |
1-3月 |
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攻毒效果 |
致病表型高度一致 |
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新冠(SARS-CoV-2)真病毒感染模型（小鼠體重變化）
DIFF 新冠假病毒感染模型（小鼠體重變化）
新冠(SARS-CoV-2)真病毒感染模型（小鼠生存率）
DIFF 新冠假病毒感染模型（小鼠生存率）
組圖5. DIFF新冠假病毒的有效性對(duì)比
*疫苗1、疫苗2為分別免疫兩種候選疫苗的小鼠實(shí)驗(yàn)組，空白對(duì)照為免疫PBS的小鼠對(duì)照組。
通過(guò)上面的組圖可知，DIFF新冠假病毒感染后，空白小鼠3天后體重驟降，5～7天均死亡。SARS-CoV-2真病毒感染后，空白小鼠3天后體重驟降，5天均死亡。兩種病毒感染小鼠后，免疫組/治療組小鼠均存活且體重變化平穩(wěn)。結(jié)果表明，DIFF新冠假病毒與SARS-CoV-2感染小鼠后具有一致的表現(xiàn)，這表明該DIFF新冠假病毒感染模型是BSL-2條件下SARS-CoV-2感染的可替代模型。
2）血清中和抗體檢測(cè)
中和抗體檢測(cè)對(duì)于臨床前以及臨床試驗(yàn)和大規(guī)模接種后疫苗效果的評(píng)估至關(guān)重要。然而，利用天然病毒進(jìn)行中和抗體檢測(cè)成本高，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的生物安全等級(jí)要求高。DIFF新冠假病毒在抗原性質(zhì)和免疫原性分析中具有很強(qiáng)的效力，可用來(lái)檢測(cè)各種血清中和抗體。
當(dāng)使用DIFF新冠假病毒感染細(xì)胞時(shí)，DIFF新冠假病毒會(huì)借助病毒囊膜表面的S蛋白與細(xì)胞膜上的ACE2蛋白相作用，進(jìn)一步感染宿主細(xì)胞并復(fù)制，報(bào)告基因eGFP或Luciferase隨即表達(dá)，其表達(dá)量與被感染的假病毒數(shù)量成正比，如果假病毒在細(xì)胞感染前與含有中和抗體的樣品共同孵育，將阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞過(guò)程。故可以通過(guò)顯微鏡下綠色熒光蛋白強(qiáng)度或化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的結(jié)果來(lái)反映樣品中和抗體的水平，綠色熒光蛋白強(qiáng)度或化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與中和抗體濃度成反比。
DIFF新冠假病毒中的報(bào)告基因eGFP為增強(qiáng)型綠色熒光蛋白，檢測(cè)靈敏度高，熒光強(qiáng)度強(qiáng)、熒光性質(zhì)穩(wěn)定，便于后續(xù)觀察與檢測(cè)（圖6）。另一種報(bào)告基因Luciferase是一種熒光素酶，可以極其靈敏、高效地檢測(cè)基因的表達(dá)，定量結(jié)果讀取更直觀，適用于的高通量篩選。
圖6.DIFF新冠假病毒（eGFP報(bào)告基因）血清中和抗體檢測(cè)案例
關(guān)于DIFF假病毒
迪福潤(rùn)絲生物構(gòu)建的新冠假病毒，基于水皰性口角炎病毒（VSV）載體，融合了新冠病毒的S蛋白，成為研究SARS-CoV-2的有力工具。這種RNA囊膜病毒通過(guò)替換VSV的G蛋白并插入報(bào)告基因（如eGFP或Luciferase），模擬天然新冠病毒的結(jié)構(gòu)和入侵細(xì)胞的機(jī)制。數(shù)據(jù)顯示，VSV新冠假病毒能夠有效感染hACE2表達(dá)的小鼠模型，同時(shí)保持高安全性，適合在BSL-2級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室操作。它的表面蛋白結(jié)構(gòu)類似于天然病毒，使其成為疫苗和藥物研發(fā)中SARS-CoV-2的理想替代（圖3）。
圖3. 迪福潤(rùn)絲生物基于VSV載體的新冠假病毒在體外和體內(nèi)應(yīng)用示意圖
VSV新冠假病毒——產(chǎn)品目錄
基于對(duì)新冠疫苗的深入研究與開發(fā)，迪福潤(rùn)絲生物構(gòu)建了含有eGPF和Luciferase熒光報(bào)告基因的多種新冠假病毒以豐富自有的生物資源庫(kù)(Bio Database)。包括新冠原始株及后續(xù)在流行中的變異毒株。新冠假病毒資源見下表：
*含現(xiàn)有及在研新冠假病毒產(chǎn)品