BBB實驗經久不衰，但在實際的操作卻很容易出現滲漏，來看看下面的構建的步驟吧，全干貨分享，點個關注，科研之途不迷路

細胞選擇：HPBC(人腦血管周細胞,啟達生物,貨號：CD5022）HBMEC(人腦微血管內皮細胞,啟達生物，貨號：CD5177）

培養基選擇：PGM(周細胞培養基,啟達生物，貨號：P4001）ECGM(內皮細胞培養基,啟達生物，貨號：P1001）

1. 為了讓原代細胞能傳更多的代次，我們可以感染hTERT病毒讓細胞進行永生化改造 ，根據實踐永生化后的細胞可傳40多代，可能SV40病毒更便宜，但是SV40感染后的細胞大部分都需要在33°增殖，而hTERT在37°就能適應。

2. 感染后的細胞需要加入Blasticidin S HCl篩選，為了保持細胞的永生化，感染后需要一直加入終濃度（f.c.）4µg/ml培養，以維持細胞更多倍增。

細胞處理好了 ，現在就開始我們的BBB實驗吧：

1. 準備24孔transwell培養板，準備好ECGM內皮細胞培養基，細胞包被液，在室溫中預熱。
2. 在超凈臺中拆開培養板，使用200ul包被液或者稀釋好的膠原酶進行培養前的細胞板包被。
3. 包被完成后，使用槍頭將包被液吸出，在每個孔中加入200ul的ECGM內皮細胞培養基，并將培養板放入培養箱中預熱。
4. 對實驗的細胞，將其從培養箱中取出，吸出培養基，以T75為例用10mL DPBS洗滌，去除DPBS，并加入4 mL 0.05%胰蛋白酶，常溫消化3-5分鐘后顯微鏡下觀察，細胞變得橢圓透亮后輕拍細胞瓶，細胞脫落，立即加入雙倍胰酶的含血清的完全培養基終止消化，并1000轉5分鐘收集細胞。
5. 用10μL臺盼藍染色制備三個0.5mL的試管，并用細胞名稱標記細胞計數室載玻片。
6. 用移液管從HBMEC或者HPBC細胞懸浮液中吸取10μL，并在0.5mL試管中與10μL臺盼藍染色混合。用移液管將10μL臺盼藍染色的細胞懸浮液移到標記細胞計數室載玻片的兩側。
7. 將HBMEC和HPBC混合按照1：1混合后（500μL，密度為1.6×105個細胞/mL）接種在細胞培養孔中的半透膜（Transwell插入物）上，形成兩個明確的隔室：頂部或上部隔室，可被視為“血液側”，基底外側或下部隔室，被視為”大腦側“，融合的細胞的單層代表血腦屏障，為了方便后期的檢測，在進行細胞定位分析時，兩種細胞細胞可以與適當的物質混合[例如，CellTracker橙色CMTMR染料（541/565 nm）、紅色熒光染料。
8. 隔天換液，細胞生長4天或達到100%融合，檢測連接復合物形成和受限的滲透性。

人腦微血管內皮細胞（HBMEC)

小細節多注意：
1. 在孔中抽吸試劑的時候，請不要觸摸微孔
2. 避免在低細胞密度水平下培養（應始終將融合率保持在50%以上）
3. 換液需謹慎，以防止細胞漂浮或細胞特征的喪失
4. 應始終向每種培養基中添加Blasticin S（f.c.4µg/mL），以保持永生化基因的表達。

相關產品推薦：

1. HBMEC

2. HPBC

3. ECGM

4. PGM

5. AGM