BBB實(shí)驗(yàn)經(jīng)久不衰，但在實(shí)際的操作卻很容易出現(xiàn)滲漏，來看看下面的構(gòu)建的步驟吧，全干貨分享，點(diǎn)個關(guān)注，科研之途不迷路
細(xì)胞選擇：HPBC(人腦血管周細(xì)胞,啟達(dá)生物,貨號：CD5022）HBMEC(人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,啟達(dá)生物，貨號：CD5177）
培養(yǎng)基選擇：PGM(周細(xì)胞培養(yǎng)基,啟達(dá)生物，貨號：P4001）ECGM(內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基,啟達(dá)生物，貨號：P1001）
1. 為了讓原代細(xì)胞能傳更多的代次，我們可以感染hTERT病毒讓細(xì)胞進(jìn)行永生化改造 ，根據(jù)實(shí)踐永生化后的細(xì)胞可傳40多代，可能SV40病毒更便宜，但是SV40感染后的細(xì)胞大部分都需要在33°增殖，而hTERT在37°就能適應(yīng)。
2. 感染后的細(xì)胞需要加入Blasticidin S HCl篩選，為了保持細(xì)胞的永生化，感染后需要一直加入終濃度（f.c.）4µg/ml培養(yǎng)，以維持細(xì)胞更多倍增。
細(xì)胞處理好了 ，現(xiàn)在就開始我們的BBB實(shí)驗(yàn)吧：
1. 準(zhǔn)備24孔transwell培養(yǎng)板，準(zhǔn)備好ECGM內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞包被液，在室溫中預(yù)熱。
2. 在超凈臺中拆開培養(yǎng)板，使用200ul包被液或者稀釋好的膠原酶進(jìn)行培養(yǎng)前的細(xì)胞板包被。
3. 包被完成后，使用槍頭將包被液吸出，在每個孔中加入200ul的ECGM內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中預(yù)熱。
4. 對實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞，將其從培養(yǎng)箱中取出，吸出培養(yǎng)基，以T75為例用10mL DPBS洗滌，去除DPBS，并加入4 mL 0.05%胰蛋白酶，常溫消化3-5分鐘后顯微鏡下觀察，細(xì)胞變得橢圓透亮后輕拍細(xì)胞瓶，細(xì)胞脫落，立即加入雙倍胰酶的含血清的完全培養(yǎng)基終止消化，并1000轉(zhuǎn)5分鐘收集細(xì)胞。
5. 用10μL臺盼藍(lán)染色制備三個0.5mL的試管，并用細(xì)胞名稱標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)室載玻片。
6. 用移液管從HBMEC或者HPBC細(xì)胞懸浮液中吸取10μL，并在0.5mL試管中與10μL臺盼藍(lán)染色混合。用移液管將10μL臺盼藍(lán)染色的細(xì)胞懸浮液移到標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)室載玻片的兩側(cè)。
7. 將HBMEC和HPBC混合按照1：1混合后（500μL，密度為1.6×105個細(xì)胞/mL）接種在細(xì)胞培養(yǎng)孔中的半透膜（Transwell插入物）上，形成兩個明確的隔室：頂部或上部隔室，可被視為“血液側(cè)”，基底外側(cè)或下部隔室，被視為”大腦側(cè)“，融合的細(xì)胞的單層代表血腦屏障，為了方便后期的檢測，在進(jìn)行細(xì)胞定位分析時，兩種細(xì)胞細(xì)胞可以與適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)混合[例如，CellTracker橙色CMTMR染料（541/565 nm）、紅色熒光染料。
8. 隔天換液，細(xì)胞生長4天或達(dá)到100%融合，檢測連接復(fù)合物形成和受限的滲透性。
人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMEC)
小細(xì)節(jié)多注意：
1. 在孔中抽吸試劑的時候，請不要觸摸微孔
2. 避免在低細(xì)胞密度水平下培養(yǎng)（應(yīng)始終將融合率保持在50%以上）
3. 換液需謹(jǐn)慎，以防止細(xì)胞漂浮或細(xì)胞特征的喪失
4. 應(yīng)始終向每種培養(yǎng)基中添加Blasticin S（f.c.4µg/mL），以保持永生化基因的表達(dá)。
相關(guān)產(chǎn)品推薦：
1. HBMEC
2. HPBC
3. ECGM
4. PGM
5. AGM