在人呼吸道合胞病毒（hRSV）抗病毒藥物的研發(fā)過程中，動物模型是進(jìn)行藥效學(xué)評價(jià)和機(jī)理研究的重要工具。科研人員長期以來投入了大量精力，嘗試構(gòu)建多種hRSV感染或疾病動物模型。然而，現(xiàn)有模型普遍存在半容許性感染、感染持續(xù)時(shí)間短等局限，限制了其在hRSV致病機(jī)制研究和新藥開發(fā)中的應(yīng)用價(jià)值。
2022年8月，《Virus》雜志發(fā)表了一篇題為《Long-Term Infection and Pathogenesis in a Novel Mouse Model of Human Respiratory Syncytial Virus》的文章，報(bào)道通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除C57BL/6小鼠的Rag2基因，成功建立了一種可遺傳的免疫缺陷小鼠模型。該模型預(yù)期能夠支持人類呼吸道合胞病毒（hRSV）的長期感染，為研究病毒的慢性感染機(jī)制和病理過程提供了新工具。
圖1.Rag2基因敲除小鼠構(gòu)建策略的示意圖
圖2.hRSV感染模型建立的攻毒及采樣時(shí)間表
研究者通過CRISPR在線工具crispr.mit.edu設(shè)計(jì)Rag2 sgRNA寡核苷酸（圖1），將線性化的pT7-sgRNA載體與退火后的sgRNA片段連接，采用MEGA ShortScriptTM Kit（Ambion）進(jìn)行體外sgRNA轉(zhuǎn)錄純化。將轉(zhuǎn)錄得到的sgRNA與Cas9 mRNA顯微注射至C57BL/6小鼠受精卵，并移植至假孕母鼠，獲得F0代小鼠。
待小鼠養(yǎng)至3周齡后，將WT小鼠（N=24）和Rag2?/?小鼠（N=24）經(jīng)鼻內(nèi)途徑接種hRSV Long株（圖2）。接種前，以戊巴比妥鈉溶液（15 mg/mL, 30 mg/kg）輕度麻醉小鼠，并緩慢將40 μL hRSV病毒懸液或DMEM培養(yǎng)液滴入小鼠鼻腔。
圖3.Rag2基因敲除小鼠體重，體溫與各呼吸器官病毒載量檢測情況
Rag2基因敲除小鼠可在鼻腔、氣管、肺等呼吸器官中高效支持hRSV病毒復(fù)制，其感染特征與臨床患者上下呼吸道感染相一致。病毒在鼻腔和肺部的復(fù)制水平極高，鼻組織在接種后第11天平均病毒載量達(dá)到1×109.8copies/g ，肺部于同時(shí)達(dá)到峰值1×10?copies/g ）。值得注意的是，這種高效感染具有持久性，即使在實(shí)驗(yàn)第35天結(jié)束時(shí)，仍未觀察到病毒滴度下降（圖3），顯示該模型能夠維持穩(wěn)定的長期感染狀態(tài)。
hRSV感染Rag2?/?小鼠后，接種4天時(shí)鼻腔、氣管未見明顯病變，肺組織僅顯示血管周圍輕度單核細(xì)胞浸潤；至第11天，鼻腔移行上皮出現(xiàn)變性伴炎性細(xì)胞浸潤，下呼吸道表現(xiàn)為支氣管肺泡擴(kuò)張受壓、中性粒細(xì)胞聚集（中心死亡降解、邊緣存活）及肺泡間隔增寬等嚴(yán)重病變；至第35天，病變明顯恢復(fù)。感染組與模擬處理的野生型小鼠均未出現(xiàn)炎性浸潤等改變，表明hRSV可誘發(fā)其輕度間質(zhì)性肺炎、嚴(yán)重支氣管肺炎及化膿性支氣管炎。本研究基于高易感性Rag2基因敲除小鼠，建立了可視化的體內(nèi)藥效評價(jià)模型，有望為未來治療藥物的研發(fā)提供可靠實(shí)驗(yàn)平臺。
迪福潤絲生物RSV體內(nèi)藥效評價(jià)動物感染模型
迪福潤絲生物依托深厚的科研實(shí)力，已成功精準(zhǔn)構(gòu)建RSV-A2毒株BALB/c小鼠感染模型，并完成從模型驗(yàn)證到藥效客觀評價(jià)的全流程、一站式CRO服務(wù)體系建設(shè)。公司采用SPF級動物與標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)流程，確保數(shù)據(jù)精準(zhǔn)可靠，為您提供從體內(nèi)藥效學(xué)到作用機(jī)制研究的有力支撐。
圖5.迪福潤絲生物一站式RSV動物感染模型體內(nèi)藥效評價(jià)服務(wù)
RSV-A2毒株BALB/c小鼠感染模型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
迪福潤絲生物使用保護(hù)液收毒法，相較于常規(guī)凍融收毒法，病毒收毒滴度顯著提高：
RSV體內(nèi)動物模型藥效評價(jià)：
圖6.RSV-2攻毒小鼠肺臟活病毒滴度測定（空斑實(shí)驗(yàn)）
圖7.RSV-2攻毒小鼠肺臟病毒載量檢測（RT-qPCR）
研究團(tuán)隊(duì)采用空斑試驗(yàn)（病毒滴度檢測金標(biāo)準(zhǔn)）與RT-qPCR（病毒載量精準(zhǔn)定量）等多項(xiàng)技術(shù)，精準(zhǔn)檢測小鼠肺組織中的病毒含量，為客觀評價(jià)抗病毒藥物的給藥效果提供關(guān)鍵、可靠的量化依據(jù)。
通過保護(hù)液收毒技術(shù)與空斑實(shí)驗(yàn)及RT-qPCR雙檢測體系的結(jié)合，迪福潤絲生物打造了創(chuàng)新型RSV藥效評價(jià)CRO服務(wù)平臺，突破傳統(tǒng)動物模型的局限。該平臺提供從模型構(gòu)建、攻毒方案到藥效定量分析的一站式服務(wù)，為抗病毒藥物研發(fā)提供低成本、高效率、可量化的全流程解決方案。
參考文獻(xiàn)：
Xiong R, Fu R, Wu Y, . Long-Term Infection and Pathogenesis in a Novel Mouse Model of Human Respiratory Syncytial Virus. Viruses. 2022 Aug 9;14(8):1740.
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