長期以來，液相核磁共振光譜測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)都是依賴于13C和15N均勻穩(wěn)定的同位素富集，以減少共振重疊，并允許在盡可能多的原子位點上進(jìn)行多距離和多角度的限制，以方便計算最佳的三維結(jié)構(gòu)模型[1]。近年來，這些標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)化增加了可修改的蛋白質(zhì)尺寸范圍，提升了三維結(jié)構(gòu)的質(zhì)量，簡化了實驗數(shù)據(jù)的分析過程[2]。同時，蛋白質(zhì)動力學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展也得益于同位素標(biāo)記技術(shù)的進(jìn)步，該技術(shù)使研究人員能夠在更廣闊的時間尺度范圍內(nèi)研究更大體積的蛋白質(zhì)運動特性，同時更準(zhǔn)確地描述蛋白質(zhì)的運動軌跡。在許多方面，動力學(xué)同位素標(biāo)記技術(shù)的進(jìn)步映射了結(jié)構(gòu)研究中所使用的技術(shù)的進(jìn)展。然而，為研究蛋白質(zhì)動力學(xué)而設(shè)計的自旋弛豫實驗對殘留標(biāo)記有獨特的要求，需要同位素富集技術(shù)的極速發(fā)展來更好地應(yīng)用于這些先進(jìn)的研究課題。

15N-標(biāo)記
迄今為止，大多數(shù)動力學(xué)研究都是通過單一的15N的富集來實現(xiàn)的。15N是一個很好的研究方向，細(xì)胞生長所需的必要氮元素可以通過易于獲得的富含15N的微量或富含氮元素的生長培養(yǎng)基來控制，使樣品制備變得容易。單一的15N標(biāo)記構(gòu)成了一個孤立的自旋系統(tǒng)（1H-15N），使得其很適合進(jìn)行弛豫實驗。無論在蛋白質(zhì)的主鏈還是側(cè)鏈中，每一個15N的位置都與另一個15N的原子通過至少兩個鍵分開。因此，沒有能導(dǎo)致復(fù)雜的多指數(shù)弛豫行為的1JNN耦合，這類耦合將很難精確測量，并會影響對相關(guān)運動的解釋。

然而，15N的富集本身并不能提供蛋白質(zhì)運動的完整圖像。氮只占蛋白質(zhì)主鏈的1/3，而且在20個氨基酸中也僅有6個側(cè)鏈中含有氮元素。因此，除了少數(shù)可選擇的位置（Asn天冬酰胺、Gln谷氨酰胺、His組氨酸、Trp色氨酸、Lys賴氨酸和Arg精氨酸），15N弛豫實驗不允許大量在蛋白質(zhì)尺寸范圍內(nèi)的動態(tài)覆蓋，以防遮擋主、側(cè)鏈的運動全貌，尤其是酰胺弛豫可能對蛋白質(zhì)疏水核心的運動相對不敏感。同時人們還注意到，通過監(jiān)測酰胺位置的弛豫，蛋白質(zhì)主干的某些運動行為是不會被檢測到的。盡管如此，15N蛋白質(zhì)標(biāo)記的便捷性、現(xiàn)有的強大實驗積累以及氮元素對結(jié)構(gòu)、靜電和氫鍵效應(yīng)的敏感性使15N成為現(xiàn)代動力學(xué)研究的重要組成部分。

13C-標(biāo)記

從表面上看，碳元素的弛豫實驗為利用核磁共振光譜進(jìn)行分子動力學(xué)研究提供了許多額外的機會。每個氨基酸中碳的豐度為酶動力學(xué)的研究提供了更多的探針。這些碳包含在主鏈和側(cè)鏈中，能夠提供整個蛋白質(zhì)的動態(tài)信息。甲基殘基通常埋在疏水核心中，特別適合提供蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性的動態(tài)過程提供信息。13C的化學(xué)位移，特別是Cα，對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的依賴比酰胺中的氮更加明顯，這使得從某些自旋弛豫實驗中獲得的化學(xué)位移變化更容易被理解。

不幸的是，理想的碳標(biāo)記方法并不像氮標(biāo)記方法那樣直接。蛋白質(zhì)中大量的碳元素能夠覆蓋在蛋白質(zhì)動力學(xué)研究中的絕大多數(shù)位置，這也是給其研究帶來的最大阻礙；大量的碳原子意味著幾乎所有的碳原子都與另一個碳原子相鄰。因此，統(tǒng)一標(biāo)記的13C蛋白樣品導(dǎo)致許多殘基存在大量的13C-13C偶聯(lián)，使得本應(yīng)能夠直接解釋弛豫行為的數(shù)據(jù)在許多情況下變得難以處理。唯一不受上述1JCC偶聯(lián)影響的位置是蛋氨酸上的甲基，它被硫原子與蛋白質(zhì)的其他部分隔開來。因此，在統(tǒng)一的13C標(biāo)記蛋白中，對動力學(xué)的研究受到很多限制。雖然蛋氨酸的弛豫數(shù)據(jù)可能非常有用，但它不能提供從碳標(biāo)記方案中獲得更加完整的動態(tài)覆蓋水平。正因為如此，許多利用已知細(xì)菌代謝途徑的同位素標(biāo)記方法已經(jīng)被開發(fā)出來。

一種用于分離13C標(biāo)志物的方法是使用15%的13C-醋酸鹽進(jìn)行部分標(biāo)記，其余保留為12C[3]。這種方法了可以將13C標(biāo)志物稀釋到一定的水平，使松弛實驗可行，但由于標(biāo)記蛋白的比例減少，信噪比也會隨之降低。

采用[3-13C]丙酮酸作為唯一的碳來源，在>90%摻入水平下，可以實現(xiàn)Leuδ、Valγ、 和Ileγ的13C標(biāo)記[4]。更重要的是，同位素標(biāo)記在很大程度上沒有打亂直接成鍵的碳，從而使得我們可以對這些殘基進(jìn)行弛豫測量。因此，在這些甲基的位置就能觀察到良好的單噪聲和單指數(shù)弛豫行為了。和蛋氨酸一樣，這些殘基可以讓我們了解蛋白質(zhì)在疏水核中的運動軌跡。

α-酮酸的使用也為生產(chǎn)13C-甲基標(biāo)記的氨基酸提供了一種經(jīng)濟有效的方法，這種氨基酸也與其他位置上高水平氘化的碳兼容[5,6]。采用氘化方法可以在比其他方法更大的蛋白質(zhì)系統(tǒng)上進(jìn)行動力學(xué)研究。這種方法的另一個好處是13C標(biāo)志物的有序性最高，從而能最大限度地減少上述由于13C-13C偶聯(lián)導(dǎo)致的問題。

在營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞系中使用1或2位置標(biāo)記的甘油允許在整個蛋白質(zhì)側(cè)鏈的大多數(shù)碳上摻入交替標(biāo)記。通常，需要兩個蛋白質(zhì)樣品才能盡可能完整地覆蓋原子位置[7]。芳香族殘基可以補充甲基基團(tuán)獲得的數(shù)據(jù)，因為它們通常也存在于疏水核心中。鑒于存在的強J偶聯(lián)以及小范圍的化學(xué)位移，這些殘基中的特定標(biāo)記尤為重要。早期研究表明，在[2-13C]位置甘油上的生長將導(dǎo)致大多數(shù)氨基酸中交替碳的同位素富集，包括 Phe、Tyr 和 Trp 中的孤立芳香碳。 在[1,3-13C]位置甘油上的生長將發(fā)生相反的標(biāo)記模式。對此的替代方法是使用[1-13C]-葡萄糖作為唯一的碳元素來源，芳香環(huán)會被標(biāo)記在Pheδ、Tyrδ、Hisδ2/ε1和Trpδ1/ε3這幾個位置上[8]。[1-13C]-葡萄糖標(biāo)記法是非常實用且高效的，因為它不僅更經(jīng)濟實惠，并且能夠得到更高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。

最近的研究則表明，[1-13C]-葡萄糖還會導(dǎo)致Ala丙氨酸、Val纈氨酸、Leu亮氨酸、Met甲硫氨酸和Ile異亮氨酸的甲基殘基富集率達(dá)到約45%，這些殘基會被兩個或多個鍵與其他13C標(biāo)記的原子隔開[9]。同時還發(fā)現(xiàn)，使用[2-13C]-葡萄糖作為唯一碳元素來源的表達(dá)顯示會導(dǎo)致在Cα位點富集率達(dá)到20-45%，不會標(biāo)記 C'位點，僅僅會標(biāo)記Leu、Val和Ile的Cβ位點。這種標(biāo)記允許CPMG弛豫實驗在Cα位置上進(jìn)行，提供更多的數(shù)據(jù)來補充常見15N CPMG實驗得到的結(jié)論。

最后，同位素標(biāo)記可以通過將所需的標(biāo)記物氨基酸直接引入生長培養(yǎng)基中來精準(zhǔn)地?fù)饺?/span>[10,11]。通常，為了避免標(biāo)記物擾亂或者被稀釋，所需的氨基酸會被包含在含有所有其他未被標(biāo)記的氨基酸混合物中，只是考慮到被標(biāo)記的同位素的位置，合成過程可能非常耗時。該技術(shù)已被證明在動力學(xué)和結(jié)構(gòu)研究中很有用，并且最近已用于大體積蛋白質(zhì)的NMR結(jié)構(gòu)測定[2]。

前景與展望

隨著越來越多的細(xì)菌代謝途徑被用于提供特定的同位素標(biāo)記，通過開發(fā)利用這些技術(shù)進(jìn)行溶液NMR弛豫實驗，可以實現(xiàn)對各種殘基類型的蛋白質(zhì)動力學(xué)行為的深入研究。

參考文獻(xiàn)

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