長期以來，液相核磁共振光譜測定蛋白質結構都是依賴于13C和15N均勻穩定的同位素富集，以減少共振重疊，并允許在盡可能多的原子位點上進行多距離和多角度的限制，以方便計算最佳的三維結構模型[1]。近年來，這些標記技術的優化增加了可修改的蛋白質尺寸范圍，提升了三維結構的質量，簡化了實驗數據的分析過程[2]。同時，蛋白質動力學領域的發展也得益于同位素標記技術的進步，該技術使研究人員能夠在更廣闊的時間尺度范圍內研究更大體積的蛋白質運動特性，同時更準確地描述蛋白質的運動軌跡。在許多方面，動力學同位素標記技術的進步映射了結構研究中所使用的技術的進展。然而，為研究蛋白質動力學而設計的自旋弛豫實驗對殘留標記有獨特的要求，需要同位素富集技術的極速發展來更好地應用于這些先進的研究課題。

15N-標記
迄今為止，大多數動力學研究都是通過單一的15N的富集來實現的。15N是一個很好的研究方向，細胞生長所需的必要氮元素可以通過易于獲得的富含15N的微量或富含氮元素的生長培養基來控制，使樣品制備變得容易。單一的15N標記構成了一個孤立的自旋系統（1H-15N），使得其很適合進行弛豫實驗。無論在蛋白質的主鏈還是側鏈中，每一個15N的位置都與另一個15N的原子通過至少兩個鍵分開。因此，沒有能導致復雜的多指數弛豫行為的1JNN耦合，這類耦合將很難精確測量，并會影響對相關運動的解釋。

然而，15N的富集本身并不能提供蛋白質運動的完整圖像。氮只占蛋白質主鏈的1/3，而且在20個氨基酸中也僅有6個側鏈中含有氮元素。因此，除了少數可選擇的位置（Asn天冬酰胺、Gln谷氨酰胺、His組氨酸、Trp色氨酸、Lys賴氨酸和Arg精氨酸），15N弛豫實驗不允許大量在蛋白質尺寸范圍內的動態覆蓋，以防遮擋主、側鏈的運動全貌，尤其是酰胺弛豫可能對蛋白質疏水核心的運動相對不敏感。同時人們還注意到，通過監測酰胺位置的弛豫，蛋白質主干的某些運動行為是不會被檢測到的。盡管如此，15N蛋白質標記的便捷性、現有的強大實驗積累以及氮元素對結構、靜電和氫鍵效應的敏感性使15N成為現代動力學研究的重要組成部分。

13C-標記

從表面上看，碳元素的弛豫實驗為利用核磁共振光譜進行分子動力學研究提供了許多額外的機會。每個氨基酸中碳的豐度為酶動力學的研究提供了更多的探針。這些碳包含在主鏈和側鏈中，能夠提供整個蛋白質的動態信息。甲基殘基通常埋在疏水核心中，特別適合提供蛋白質折疊和穩定性的動態過程提供信息。13C的化學位移，特別是Cα，對蛋白質二級結構的依賴比酰胺中的氮更加明顯，這使得從某些自旋弛豫實驗中獲得的化學位移變化更容易被理解。

不幸的是，理想的碳標記方法并不像氮標記方法那樣直接。蛋白質中大量的碳元素能夠覆蓋在蛋白質動力學研究中的絕大多數位置，這也是給其研究帶來的最大阻礙；大量的碳原子意味著幾乎所有的碳原子都與另一個碳原子相鄰。因此，統一標記的13C蛋白樣品導致許多殘基存在大量的13C-13C偶聯，使得本應能夠直接解釋弛豫行為的數據在許多情況下變得難以處理。唯一不受上述1JCC偶聯影響的位置是蛋氨酸上的甲基，它被硫原子與蛋白質的其他部分隔開來。因此，在統一的13C標記蛋白中，對動力學的研究受到很多限制。雖然蛋氨酸的弛豫數據可能非常有用，但它不能提供從碳標記方案中獲得更加完整的動態覆蓋水平。正因為如此，許多利用已知細菌代謝途徑的同位素標記方法已經被開發出來。

一種用于分離13C標志物的方法是使用15%的13C-醋酸鹽進行部分標記，其余保留為12C[3]。這種方法了可以將13C標志物稀釋到一定的水平，使松弛實驗可行，但由于標記蛋白的比例減少，信噪比也會隨之降低。

采用[3-13C]丙酮酸作為唯一的碳來源，在>90%摻入水平下，可以實現Leuδ、Valγ、 和Ileγ的13C標記[4]。更重要的是，同位素標記在很大程度上沒有打亂直接成鍵的碳，從而使得我們可以對這些殘基進行弛豫測量。因此，在這些甲基的位置就能觀察到良好的單噪聲和單指數弛豫行為了。和蛋氨酸一樣，這些殘基可以讓我們了解蛋白質在疏水核中的運動軌跡。

α-酮酸的使用也為生產13C-甲基標記的氨基酸提供了一種經濟有效的方法，這種氨基酸也與其他位置上高水平氘化的碳兼容[5,6]。采用氘化方法可以在比其他方法更大的蛋白質系統上進行動力學研究。這種方法的另一個好處是13C標志物的有序性最高，從而能最大限度地減少上述由于13C-13C偶聯導致的問題。

在營養缺陷型細胞系中使用1或2位置標記的甘油允許在整個蛋白質側鏈的大多數碳上摻入交替標記。通常，需要兩個蛋白質樣品才能盡可能完整地覆蓋原子位置[7]。芳香族殘基可以補充甲基基團獲得的數據，因為它們通常也存在于疏水核心中。鑒于存在的強J偶聯以及小范圍的化學位移，這些殘基中的特定標記尤為重要。早期研究表明，在[2-13C]位置甘油上的生長將導致大多數氨基酸中交替碳的同位素富集，包括 Phe、Tyr 和 Trp 中的孤立芳香碳。 在[1,3-13C]位置甘油上的生長將發生相反的標記模式。對此的替代方法是使用[1-13C]-葡萄糖作為唯一的碳元素來源，芳香環會被標記在Pheδ、Tyrδ、Hisδ2/ε1和Trpδ1/ε3這幾個位置上[8]。[1-13C]-葡萄糖標記法是非常實用且高效的，因為它不僅更經濟實惠，并且能夠得到更高的蛋白質產量。

最近的研究則表明，[1-13C]-葡萄糖還會導致Ala丙氨酸、Val纈氨酸、Leu亮氨酸、Met甲硫氨酸和Ile異亮氨酸的甲基殘基富集率達到約45%，這些殘基會被兩個或多個鍵與其他13C標記的原子隔開[9]。同時還發現，使用[2-13C]-葡萄糖作為唯一碳元素來源的表達顯示會導致在Cα位點富集率達到20-45%，不會標記 C'位點，僅僅會標記Leu、Val和Ile的Cβ位點。這種標記允許CPMG弛豫實驗在Cα位置上進行，提供更多的數據來補充常見15N CPMG實驗得到的結論。

最后，同位素標記可以通過將所需的標記物氨基酸直接引入生長培養基中來精準地摻入[10,11]。通常，為了避免標記物擾亂或者被稀釋，所需的氨基酸會被包含在含有所有其他未被標記的氨基酸混合物中，只是考慮到被標記的同位素的位置，合成過程可能非常耗時。該技術已被證明在動力學和結構研究中很有用，并且最近已用于大體積蛋白質的NMR結構測定[2]。

前景與展望

隨著越來越多的細菌代謝途徑被用于提供特定的同位素標記，通過開發利用這些技術進行溶液NMR弛豫實驗，可以實現對各種殘基類型的蛋白質動力學行為的深入研究。

參考文獻

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9. Lundstr?m P, Teilum K, Carstensen T, Bezsonova I, Wiesner S, Hansen DF, Religa TL, Akke M, Kay LE. 2007. Fractional 13C enrichment of isolated carbons using [1-13C]- or [2-13C]-glucose facilitates the accurate measurement of dynamics at backbone C? and side-chain methyl positions in proteins. J Biomol NMR. 38(3):199-212. https://doi.org/10.1007/s10858-007-9158-6

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