誘導多能干細胞（iPSC）是一種可以產生并提供了一種體外模擬神經組織發(fā)育的方法。iPSC特別有趣的分化應用是類似于在人類認知和感覺處理中神經元起著核心作用，神經元活動的缺陷導致了許多疾病，包括癲癇、阿爾茨海默氏癥疾病和精神分裂癥，IPS誘導神經元該怎么操作呢？
?一.培養(yǎng)
1. 使用二級生物安全柜，使用適當尺寸的移液管將iPSC在60 mm培養(yǎng)皿中的STEMCult™-XF細胞培養(yǎng)基（啟達生物，貨號：P2501)中培養(yǎng)。如果從冷凍的iPSC凍存管開始，至少接種300000個細以上。
2. 細胞達到15%-25%的融合度，抽吸用過的培養(yǎng)基以去除未附著的細胞，并檢查細胞團塊的大小。如果直徑約為100-200µm，則其大小適合開始分化。使用5毫升移液管將3毫升在水浴中預熱的STEMCult-NDM神經細胞分化培養(yǎng)基（啟達生物，貨號：P1101)加入培養(yǎng)皿里并輕輕放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。如果平板中沒有滿足100-200um得大小團塊，則加入3ml STEMCult™-XF細胞培養(yǎng)基（啟達生物，貨號：P2501)，每天檢查，直到菌落達到合適的大小后才能開始誘導，誘導培養(yǎng)基需要每天換液直到細胞達到完全融合的狀態(tài)，換液的時候標記出任何非神經分化的細胞團塊并用200ul的移液槍去除這些不需要的菌落.
3. 當誘導的細胞密度達到70%以上，將神經誘導培養(yǎng)基的體積增加一倍對細胞營養(yǎng)至關重要。此外，在神經誘導后的第4天至第7天應觀察到最小的細胞死亡。如果在神經誘導的第4天至第7天，細胞的顏色變黃，有許多漂浮的細胞，則表明iPSC的起始密度過高。在這種情況下，每天更換神經誘導培養(yǎng)基，去除一些菌落，并將每個孔/板的體積增加一倍。理想情況下，使用這些變量以確保介質不會繼續(xù)變黃。當達到95%以上開始傳代操作.
?二.傳代
1. 從每個待傳代的平板中吸出用過的STEMCult-NDM神經細胞分化培養(yǎng)基。
2. 將不含CaCl2和MgCl2的DPBS輕輕添加到每個板中兩次，以沖洗細胞。
3. 向每個平板中加入1.5 ml預熱0.02%EDTA胰酶，并在37°C下孵育3-5分鐘，直到大多數細胞從培養(yǎng)容器表面分離。輕輕拍打平板，使細胞脫落，并加雙倍以上完全培養(yǎng)基中和并輕輕吹打。
4. 用移液管將細胞懸浮液轉移到15 ml錐形管中。
5. 向每個板加入1ml DPBS以收集殘余細胞，并將細胞懸浮液轉移到錐形管中。
6. 用5毫升或10毫升的移液管輕輕地上下移取細胞懸浮液3次，以打碎細胞團塊。
7. 將細胞以300 x g離心5分鐘。
8. 吸取上清液，并將細胞重新懸浮在預熱的STEMCult-NDM神經細胞分化培養(yǎng)基中（即，來自每個板的所有細胞為10ml）。
9. 將懸浮在STEMCult-NDM神經細胞分化培養(yǎng)基的細胞平板到10cm培養(yǎng)皿上。
10. 在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞2天。在此期間，細胞在培養(yǎng)基中漂浮時會形成聚集。
11. 一旦聚集體達到約70-200µm的適當尺寸，制備一個涂有5 ml Matrigel®的10 cm組織培養(yǎng)皿至少1小時。如果形成的聚集體很少，則將細胞置于60 mm培養(yǎng)皿中。
12. 使用5毫升或10毫升移液管，取下STEMCult-NDM神經細胞分化培養(yǎng)基并通過細胞濾網收集分化的神經細胞。
13. 反轉過濾器，將10 ml新鮮預熱的STEMCult-NDM神經細胞分化培養(yǎng)基通過過濾器，在過濾器中結合細胞聚集體，將其轉移到Procult™ Matrigel基質膠(啟達生物，貨號：SD0058)涂層的10 cm板上。
14. 在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞，使細胞聚集體附著在包被的培養(yǎng)皿上并遷移和增殖。
15. 每2-3天更換一次培養(yǎng)基，直到細胞達到融合，并準備好傳代或冷凍保存。在37°C溫度下使用溫熱的accutase細胞消化液室溫消化5分鐘。
16. 將STEMCult-NDM放置在涂有Matrigel®的組織培養(yǎng)皿上。等待細胞達到70%-95%的融合后再開始分化。
17. 一旦細胞達到所需的融合度，抽吸培養(yǎng)基并用等量的正常神經元培養(yǎng)基代替。
18. 每隔2-3天，吸取培養(yǎng)皿中一半的培養(yǎng)基，并更換為新鮮的正常神經元培養(yǎng)基。
注意：由于培養(yǎng)基會因蒸發(fā)而流失，換液的時候盡量要吸干凈以維持細胞的生長平衡。
這個培養(yǎng)的階段NPC細胞的純度將很容易被檢測到。含有高百分比NPC的細胞系將迅速極化并形成神經元投射（通常在2-5天左右），而含有高百分比非NPC細胞（星形細胞、神經嵴細胞等）的細胞系則不會。
?三.檢測
01.顯微鏡肉眼觀察
第5天=細胞細胞鋪板形態(tài)：細胞分裂后形態(tài)
第15天=細胞具有明顯極化的軸突和樹突，并具有明顯可檢測的電生理特性，如動作電位
02.免疫熒光染色
1.將細胞種在涂有多聚賴氨酸和層粘連蛋白的玻璃蓋玻片讓細胞爬滿
2.將樣品固定在PBS中稀釋的4%多聚甲醛（PFA）中。在室溫下培養(yǎng)15分鐘。
3.在室溫下用PBS（3 x 15分鐘）洗滌樣品。
4.通過在室溫下在PBS+0.1%Triton X-100中孵育10分鐘來滲透樣品。
5.吸取透化緩沖液，用PBS中稀釋的5%BSA代替以封閉樣品。在室溫下培養(yǎng)60分鐘。
6.通過在封閉5%BSA-PBS中稀釋制備一級抗體的工作儲備。不同細胞類型的推薦工作稀釋液和抗體見表1。將蓋玻片置于一級抗體溶液中，并在2-8°C下孵育過夜
7.在室溫下用PBS（3 x 15分鐘）洗滌樣品。
8.吸取PBS并加入在5%BSA-PBS中稀釋的二次抗體。將蓋玻片在室溫下避光培養(yǎng)一小時。
9.在室溫下用PBS（3 x 15分鐘）洗滌樣品。
10.如果需要，加入在PBS中稀釋的DAPI，在室溫下孵育5分鐘。
11. 在載玻片中加入一滴Vectashield®。小心地使用針頭和鉗子將蓋玻片從細胞側向下轉移到玻片上。用指甲油密封，上機拍照。
03.使用電生理學評估神經元質量
1. 從玻璃毛細管上拔下移液管。當填充內部移液管溶液時，其電阻應在3至6 MΩ之間。
2. 將含有分化的人iPSC衍生神經元的單個蓋玻片轉移到加熱的記錄室中，用不含苯酚的神經元培養(yǎng)基連續(xù)灌注（1 ml/min），用CO2（5%）和O2（95%）的混合物鼓泡，并使用自動溫度控制器保持在35°C。
3. 選擇要檢測的培養(yǎng)孔。
4. 在移液管中注入內部移液管溶液，并將其放置在電極支架中。降低移液管，將其放入外部溶液中。補償偏移后，在遠程微操作器的幫助下，將移液管接近所選的細胞，以形成高電阻細胞附著密封。
5. 一旦形成密封并建立了整個電池配置，需要80%-90%的串聯(lián)電阻。
6. 等待5到10分鐘后再開始記錄。細胞內容物與內部移液管溶液一定要平衡。
對于采集，將濾波器設置為2 kHz，采樣率設置為20 kHz。?
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