編者按：
? ? ? ?遺傳類疾病是主要疾病類型之一，兒童住院類型中高達70%是遺傳類疾病，成人住院類型中也有10%是因為遺傳類疾病。許多最常見的遺傳性疾病，包括地中海貧血癥、囊性纖維化和鐮狀細胞病，目前能做的也只有支持性護理，仍然缺乏有效的治療方案。人類基因組計劃其中一個預期目標，是通過鑒定導致遺傳類疾病的基因，并采用基因修復的方式來促進對疾病的治療，而實現這一目標最重要的途徑是發展治療性基因的在體遞送方案。體內基因置換治療遺傳性疾病是現代醫學中最引人注目的概念之一。腺相關病毒（AAV）載體已被廣泛用于這一目的，并已證明在一系列動物模型中的治療效果。成功的轉化醫學研究起步較慢，但替換基因在治療水平上的長期表達現已被證實在遺傳性視網膜疾病和血友病B患者中取得了成功。近期令人振奮的結果也為許多其他疾病的治療帶來了希望。
? ? ? ?基因治療的臨床試驗開始于20多年前，在過去幾十年中，對于人類遺傳性疾病的基因治療的成功案例穩步遞增。在遺傳性疾病的基因治療策略中，普遍認可的方案是兩種病毒載體，即體外基因遞送到造血細胞和其他干細胞的慢病毒（LV）載體，以及在體將病毒遞送到病變組織的腺相關病毒(AAV)載體。臨床研究發現，這兩種病毒載體的毒性特征完全不同，LV載體的主要安全問題是插入突變相關的風險，而AAV載體主要的安全問題是影響病毒發揮作用的免疫反應。
? ? ? ?小編在這里給大家推薦Mingozzi F和High KA發表在《Nature Reviews Genetics》題為“Therapeutic in vivo gene transfer for genetic disease using AAV：progress and challenges”的綜述文章，本文作者重點介紹了利用AAV在體進行體內基因遞送治療遺傳性疾病的最新進展。迄今為止體內基因遞送最有臨床轉化潛力的是AAV載體，AAV基因治療的前景和挑戰很大程度上取決于靶組織和特定疾病 。AAV載體體內基因遞送面臨的最常見的挑戰是組織特異的免疫反應，因此本綜述是圍繞AAV載體靶向特定組織（如：視網膜、中樞神經系統、肝臟和骨骼肌等）相關的進展和挑戰進行論述。
表一. AAV載體體內遞送的臨床試驗進展
? ? ? ?AADC：芳香族L-氨基酸脫羧酶；AAV：腺相關病毒；CFTR：囊性纖維化跨膜轉運調節因子；CLN2/TPP1：三肽基肽酶1；GAA：酸性α-葡萄糖苷酶；GAD：谷氨酸脫羧酶；LPL：脂蛋白脂肪酶；NA：未提供；RPE65：視網膜色素上皮特異蛋白65KDa；SERCA2a：肌漿網鈣ATP酶2a；sFLT01：血管內皮生長因子天然受體的一部分；TNFR-Fc：腫瘤壞死因子受體-免疫球蛋白Fc片段融合蛋白。
一、基因遞送至視網膜
? ? ? ?使用AAV載體進行臨床體內基因遞送最引起廣泛關注的是視網膜退行性疾病—Leber先天性黑蒙癥（LCA）。LCA是由于常染色體14種基因之一或者組合突變引起的。在RPE65(編碼視網膜色素上皮特異65 kDa蛋白的基因)突變導致的Leber先天性黑蒙癥小鼠模型或者犬類模型中，通過視網膜下注射表達RPE65的AAV載體，均實現了良好的治療效果?；谶@個振奮人心的消息，在2007年開展了利用AAV載體在體遞送RPE65基因以治療LCA的臨床試驗。在臨床治療的25名患者中，均沒有明顯的不良反應，并且在三年時間內，患者的視覺功能的心理物理測量(視力和視野)、客觀測量(如瞳孔光反應或全場感光度)和功能測量(如在昏暗的光線下穿越障礙的能力)數據均有持續的明顯改善。目前正在進行和計劃進行的臨床和基礎試驗可能會改變眼科實踐的研究方向，例如需要對遺傳性視網膜退行性疾病患者進行基因分型、對外科醫生視網膜下注射方面的專業知識和技能有更高要求。
? ? ? ?但我們必須認識到遺傳疾病的一個關鍵問題：實施基因治療的疾病階段對臨床療效的影響。例如在基因治療血友病時，到某個階段之后，即使凝血因子恢復到正常水平，復發性血栓造成的關節進行性損傷是永久性不可逆的。由于患病人群規模小，盡管有令人信服的臨床前數據，RPE65基因治療方案并沒有吸引到商業資金進行臨床試驗。然而，這種疾病的概念證明為一系列更常見的遺傳性視網膜退行性疾病的臨床試驗奠定了基礎，例如Leber遺傳性視神經病變、脈絡膜血癥、X連鎖視網膜劈裂(NCT00055029)，與年齡相關的視網膜黃斑變性(NCT01024998)等。
圖1. AAV治療視網膜退行性疾病—Leber先天性黑蒙癥
二、基因遞送至肝臟
? ? ? ?肝臟是機體主要的合成器官之一，是在體基因遞送研究的理想組織。目前基礎研究的體內基因遞送到肝臟可治療各種血漿蛋白缺乏癥和代謝紊亂，如鳥氨酸氨甲?；D移酶（OTC）缺乏癥，甲基丙二酸血癥，家族性高膽固醇血癥、溶酶體貯積癥等。在臨床領域的成功一直比較緩慢，但最近的研究表明，朝著長期表達的目標取得的進展正在發生。
表二. AAV體內基因遞送至肝臟治療動物疾病模型
? ? ? ?AAV：腺相關病毒；AGA：α-半乳糖苷酶A；CBS：胱硫醚-β-合成酶；cG6Pase：葡萄糖-6-磷酸酶；GC：葡萄糖腦苷脂酶；GSD-Ia：糖原貯積病Ia型；GUSB：β-葡萄糖醛酸糖苷酶：Hfe：血色??；IDUA：艾杜糖醛酸酶；LDL：低密度脂蛋白；LDLR：LDL受體；MPS：粘多糖貯積癥；OTC：鳥氨酸氨甲?；D移酶；PCCA：丙酰輔酶A羧化酶α多肽；PKU：苯丙酮尿癥；UGT1A1：UDP（尿苷二磷酸）-葡糖醛酸基轉移酶1家族多肽A1。
1.AAV肝臟注射治療血友病B
? ? ? ?血友病B是一種由編碼凝血因子IX基因突變引起的遺傳性疾病，目前治療這種疾病的方式是靜脈輸注凝血因子，但由于這些藥物相當昂貴，世界上只有大約20%的血友病患者能負擔得起。而AAV肝臟注射是治療嚴重血友病B的一個有轉化前景的治療方案。最初的臨床前AAV治療方案是基于兩個血友病B動物模型，由于其良好的治療效果引起臨床的重視，隨后在臨床試驗中，對8名患有嚴重血友病B的受試者骨骼肌注射攜帶編碼凝血因子IX基因的AAV2載體，取得一定療效。但該載體要想通過肝動脈給藥，有幾個必須要考慮的問題：首先，AAV載體以前從未被注射到人類受試者的肝臟中，且基因治療試驗中唯一的死亡病例是腺病毒載體被注射到OTC缺乏癥受試者的肝臟。同時在一名受試者的治療過程中發現，凝血因子IX水平的升高只持續了大約10周，并沒有達到長期治療的目的。
圖2. AAV注射到肝臟治療面臨的障礙
? ? ? ?目前認為在體感染時，AAV載體基因組從衣殼中釋放出來進入細胞內。產生的衣殼衍生肽被加載到主要組織相容性復合體I(MHCI)上，并出現在感染細胞的表面。此類肝細胞可能被特異性CD8+T細胞識別，進而清除感染的細胞，導致療效的中斷。
圖3. 血友病B的IX因子功能缺陷治療障礙
2.AAV肝臟注射的未來前景
? ? ? ?如何在肝臟注射試驗中避免檢測到的免疫反應是基因治療效果穩定性的關鍵。目前可以采用AAV載體與短期免疫抑制劑聯合用藥，試圖阻止衣殼特異性T細胞反應的激活，避免感染的肝細胞被免疫清除。此外，設計出更有效率的病毒表達載體是一個更好的治療策略，因為載體的劑量較低，在保證治療基因凝血因子IX表達的同時，又可避免引起免疫反應。
三、基因遞送至中樞神經系統（CNS）
? ? ? ?對于遺傳性退行性疾病的體內基因遞送到中樞神經系統的早期臨床研究并不多，目前也沒有像視網膜退行性疾病那樣取得明顯成功的案例。該方案目前有兩個明顯的局限性，第一是局部腦區遞送和全腦區遞送的問題，雖然在帕金森氏病等少數疾病發現局部遞送可以起到治療作用，但對于大多數神經退行性疾病，需要將AAV載體向中樞神經系統進行全腦區遞送。第二個問題是如何透過血腦屏障(BBB)的問題，這是所有向中樞神經系統提供治療的藥物都會面臨的障礙。目前針對以上兩個主要問題，神經科學家們進行了一系列的探索實驗。
1.工程化的病毒載體
? ? ? ?確定用于CNS基因轉移的最佳AAV載體血清型一直以來是研究熱點。AAV1介導的CLN2(編碼三肽基肽酶1，也稱TPP1)基因遞送在晚期神經元蠟樣脂褐質沉積癥（NCL）幼鼠模型中顯示出良好的治療結果。通過工程化修飾AAV載體衣殼，改變其趨向性也是該領域的研究熱點?？茖W家通過鑒定腦疾病模型中內皮細胞獨特的多肽，并將其插入載體衣殼中，可介導治療性基因載體透過BBB遞送到整個大腦。
2.遞送技術
? ? ? ?除了工程化AAV病毒載體之外，增強病毒的遞送技術也十分重要。對流增強遞送技術，即利用流體靜壓強將藥物注射到血管周圍進一步在腦實質中擴散的技術，已經成功地運用在非人靈長類動物遞送AAV載體。將AAV載體注入腦室使得病毒載體能在腦脊液中循環，也能實現更廣泛的中樞神經系統的感染。而使用立體定位注射技術將病毒注射到局部腦區中，可實現對中樞神經系統特定腦區的感染。近期已有通過立體定向注射技術，將病毒注射到帕金森氏病患者的紋狀體相關的臨床試驗。
3.遞送到CNS的其他考慮因素
? ? ? ?關于將治療基因遞送到中樞神經系統，還有其他需要考慮的因素。例如，要把握這些中樞系統的遺傳性疾病的最佳治療窗口期，一般需要在中樞神經系統發生不可逆轉的變化之前進行治療干預。
四、基因遞送至骨骼肌
? ? ? ?體內基因遞送至骨骼肌可治療神經肌肉和新陳代謝相關遺傳性疾病，例如α1抗胰蛋白酶缺乏癥、脂蛋白脂肪酶缺乏癥。通過肌肉注射將AAV載體注射到骨骼肌有許多優點，例如遞送過程簡單、病毒在靶組織外的擴散相對較少、對AAV載體的體液免疫效果較弱等。
1.肌肉注射AAV載體
? ? ? ?第一項肌肉注射AAV載體的臨床研究是1999年對治療血友病B的治療。在治療過程中，8名受試者的肌肉組織均檢測到轉導靶基因凝血因子IX的表達，體現了該治療方案的安全性和良好的耐受性。但是在體液循環中，檢測到表達凝血因子IX的量低于臨床的治療劑量。這可能與體內免疫系統產生的中和抗體有關。在另一項以AAV1載體進行肌肉注射治療α1抗胰蛋白酶缺乏癥的臨床過程中也發現，病毒表達的蛋白在循環里檢測的劑量遠遠低于治療使用的蛋白劑量。因此，在進行肌肉注射AAV載體進行治療時，需要更有效的病毒表達載體和更好的免疫逃逸作用。
2.大范圍肌肉組織進行基因遞送
? ? ? ?肌肉組織的基因遞送治療的一個主要目標是肌營養不良癥。根據靜脈壓力可以可逆地改變毛細血管微靜脈中相鄰內皮細胞的接觸強度，從而導致病毒載體從循環滲出到肌肉組織的原理，可在肌肉組織進行安全有效地病毒感染。目前這種方法在貝克氏肌營養不良癥患者身上進行了初步的臨床試驗。
3.病毒衣殼引起的免疫反應
? ? ? ?將治療基因表達到肌肉組織中面臨最重要的挑戰是避免病毒衣殼激發免疫反應導致的負面影響。目前發現針對AAV衣殼，T細胞具有較高的靈敏度，在較高的病毒載體劑量下，受試者的T細胞數量顯著增加。另外高劑量的載體時，發現在外周血很早就出現了衣殼特異性T細胞的激活。衣殼特異性T細胞的激活可能受到以下因素的影響，包括：轉導靶基因自身的免疫調節特性；靶組織中主要組織相容性復合體(MHC)I類的表達水平；靶組織中的炎癥；反應性T細胞的凋亡；以及受試者的人類白細胞抗原(HLA)等位基因引起的變異。在未來AAV載體注射的臨床研究中，對病毒衣殼免疫反應的臨床監測將是解決上述問題的關鍵。
五、展望
? ? ? ?通過病毒載體的基因遞送是迄今為止最有前景和最復雜的治療方案，在基因和蛋白層面對疾病的預后發揮重要作用。盡管目前基因治療策略在臨床上已經取得了初步的治療效果。但是由于解剖學和免疫學上的一些問題，體內基因遞送仍然存在許多組織特異性的障礙。并且在使用AAV進行臨床治療的過程中，必須要明確疾病干預的階段對于治療效果的重要性，必須要把握AAV基因傳遞的起效劑量和持續時間，必須解決AAV載體插入引起的突變風險并保障其安全性?？偠灾?，只要充分發揮AAV基因遞送療法的優勢，優化病毒的表達效率和免疫反應，AAV載體的基因遞送療法將是解決一系列遺傳性疾病最好的治療選擇。
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