/article/300/30012.png?access_token=be933d0d-eea0-4808-b93a-5fe1c64e9ddd" style="outline: none; padding: 0px; margin: 0px; border: 0px; max-width: 100%; height: auto;">
圖12.電泳緩沖液對(duì)電泳的影響。(A) 在電泳過程中，凝膠的頂部部分未被浸沒。(B) 在低于推薦濃度的鹽濃度緩沖液中運(yùn)行凝膠（與凝膠制備中使用的緩沖液不同）。
注意，變性瓊脂糖的電泳緩沖液可能既不是TAE，也不是TBE，因?yàn)檫@些凝膠可能在不同的緩沖液中制備，如磷酸鈉和MOPS。選擇與所用凝膠兼容的電泳緩沖液非常重要（圖12B）。
b.電壓
采用恒定電壓、電流或功率通過凝膠，施加電勢(shì)，開始運(yùn)行凝膠。核酸電泳中常用恒壓，一般為5–10 V/cm。
施加的電壓(V)=電極間的距離(cm)x建議V/cm
可根據(jù)需要分離的DN**段的大小調(diào)整電壓，也可以根據(jù)所使用的電泳緩沖液的類型進(jìn)行調(diào)整（表 8）。市售核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)通常提供建議電壓，以便每個(gè)產(chǎn)品片段實(shí)現(xiàn)最佳分離。注意，電壓極低會(huì)減緩核酸的遷移，從而導(dǎo)致小分子的擴(kuò)散和分辨率過低（圖13A）。另一方面，電壓過高，會(huì)導(dǎo)致較差的分離效果和樣品污點(diǎn)；有時(shí)，還會(huì)造成緩沖液過熱，“微笑型條帶”，甚至是樣品變性（圖13B）。
圖13. 電壓對(duì)DNA電泳的影響。 (A)低電壓導(dǎo)致條帶分辨率差和擴(kuò)散。 (B)高電壓導(dǎo)致“微笑型條帶”。
某些情況下，可將溫度探頭連接至凝膠裝置，以幫助控制緩沖液的冷卻和加熱。 電泳運(yùn)行>2小時(shí)，緩沖液的冷卻和再循環(huán)可改善樣品分離。變性凝膠允許緩沖液加熱至55°C，從而改善核酸單鏈形式，提升實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
c.運(yùn)行時(shí)間
凝膠長(zhǎng)度、所用電壓和樣品中的分子大小決定電泳所需的時(shí)間。通常，電泳會(huì)持續(xù)到目的條帶遷移至凝膠長(zhǎng)度的40-60%。凝膠運(yùn)行的特定時(shí)間，可觀察到上樣染料的相對(duì)位置，直至溴酚藍(lán)染料已遷移約60%的凝膠長(zhǎng)度和/或橙G染料已遷移80%的凝膠長(zhǎng)度。此外，應(yīng)監(jiān)測(cè)運(yùn)行時(shí)間，以確保樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中最小的分子不移出凝膠。注意，運(yùn)行時(shí)間過短則不能完全分辨條帶（圖14）。含有示蹤染料的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)可協(xié)助監(jiān)測(cè)凝膠的運(yùn)行，同時(shí)也可確保條帶不被染料所遮蓋。
圖14.運(yùn)行時(shí)間對(duì)樣品分離的影響。
4.在凝膠中可視化樣品
凝膠運(yùn)行完成后，需對(duì)樣品進(jìn)行可視化分析。由于普通照明環(huán)境下，核酸不可見，因此需要一種可視化的檢測(cè)方法。如表9所述，可用方法在樣品檢測(cè)中，提供了不同的靈敏度和增益范圍[6]。
a.熒光染色
現(xiàn)有的染色劑中，因熒光染料易于使用，靈敏度高，所以在樣品檢測(cè)中應(yīng)用最為廣泛(圖15)。 當(dāng)用適當(dāng)波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)，染料發(fā)出可見光(即，熒光)。熒光強(qiáng)度與其和核酸結(jié)合的數(shù)量有關(guān)—這是檢測(cè)和定量測(cè)定電泳中核酸的基礎(chǔ)。
圖15.不同類型的核酸結(jié)合染料。
溴化乙錠(EtBr) 染色時(shí)間短（約30分鐘），靈敏度高（可檢測(cè)到1 ng雙鏈DNA/條帶），為核酸電泳中的常用熒光染料。還可考慮另一種染料，原因如下:
誘變和處置: 溴化乙錠是高度誘變劑，所以熒光染料的 危險(xiǎn)性較小，無需特殊處理，在核酸電泳中可提供安全工作流程(圖16)。
靈敏度：靈敏度高于EtBr的熒光染料，適合檢測(cè)少量樣品(圖16)。 因?yàn)橛休^少的堿基堆積，單鏈核酸的可視化通常需要更多樣品和/或嵌入染料。 因此， 優(yōu)先結(jié)合單鏈核酸的染料是RNA電泳樣品檢測(cè)的最佳選擇。
紫外線損害：可用低能量藍(lán)光（而非紫外光）來激發(fā)的熒光染料對(duì)核酸結(jié)構(gòu)損傷較小，其靈敏度（圖17A）不僅相同，甚至更高。 因此，電泳中使用藍(lán)光激發(fā)可提高下游的成功應(yīng)用，如克隆和測(cè)序（圖17B）。
圖16.特性增強(qiáng)的溴化乙錠替代品
圖17.(A)常見核酸染色的激發(fā)和發(fā)射光譜。最有效的波長(zhǎng)被稱為激發(fā)極大值。SYBR安全與SYBR金染料通過藍(lán)光和較低的紫外光可最大程度激發(fā)。(B)用藍(lán)光(針對(duì)SYBR安全染料)或紫外光(溴化乙錠)后的克隆效率，用于在電泳過程中顯示克隆插入。用x-Gal培養(yǎng)皿上形成的藍(lán)色菌落數(shù)量來衡量膠-純化lacZ片段的克隆效率，其表明已將功能(未突變的)基因插入到載體中。
b.紫外陰影
在染料染色處，可通過稱作紫外陰影的方法間接觀察核酸，利用核酸[8]來吸收紫外線。該方法通常用于通過電泳分離和純化寡核苷酸和RNA，這種情況下，簡(jiǎn)單檢測(cè)已足夠，和/或使用嵌入染料會(huì)影響下游的應(yīng)用。為通過紫外陰影進(jìn)行檢測(cè)，需要納克到微克的樣品，并使用薄而透明的凝膠（如聚丙烯酰胺）以確保紫外線的吸收和透射。紫外陰影方法中，電泳后將凝膠從盒中取出（以便最大程度檢測(cè)），用透明的塑料薄膜包裹后放置在UV-熒光薄層色譜板上。當(dāng)凝膠至于紫外線輻射下時(shí)，核酸條帶的吸收會(huì)在TLC板上投射陰影（圖18）。將所需大小凝膠的陰影部分剪去，以作進(jìn)一步處理。
圖18.紫外陰影使分離的片段顯象。
5.記錄凝膠
a.熒光成像技術(shù)
可視化后，核酸凝膠通常被存檔記錄下來，用于記錄和分析電泳結(jié)果。如果樣品被熒光染料染色，需特殊設(shè)備以適當(dāng)?shù)墓庠醇ぐl(fā)染料，使其顯象并捕捉凝膠圖像。激發(fā)光源在凝膠上，稱為反射照明器（類似于手持式紫外線燈），或在凝膠下，稱為透照器 (圖19)。由于反射照明器上的光源位置較遠(yuǎn)，所以樣品收到的能量較少。這樣可以減少紫外線對(duì)核酸的損害，但也會(huì)降低凝膠條帶的信號(hào)。另一方面，透照器可為條帶提供更高的信號(hào)，但由于輻射接近凝膠，會(huì)增加紫外線造成的傷害。
圖19.反射照明器和透照器。
b.放射自顯影法
在放射性核酸的電泳過程中，凝膠電泳后會(huì)暴露在x射線膠片上，這一過程即稱為 放射自顯影法。條帶輻射的強(qiáng)度可用光密度測(cè)定來定量。
綜上所述，核酸電泳工作流程采用多種步驟和試劑來分離和分析樣品。為您的樣品選擇合適工具，并識(shí)別工作流程的優(yōu)缺點(diǎn)，可顯著提高分子生物學(xué)應(yīng)用的電泳結(jié)果。
參考文獻(xiàn)
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凝膠電泳是許多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的重要部分。建立核酸電泳需采取一系列步驟來實(shí)現(xiàn)核酸樣品的最佳分離和分析。核酸凝膠電泳工作流程中的關(guān)鍵步驟包括:
1.選擇和制備凝膠
a.瓊脂糖凝膠 b.聚丙烯酰胺凝膠 c.凝膠制備中的緩沖液選擇
2.準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品和樣品
a.核酸梯度選擇 b.樣品和梯度準(zhǔn)備 c.加載染料和緩沖液選擇
3.運(yùn)行電泳
a.電泳緩沖選擇 b.電壓 c.電泳時(shí)間
4.在凝膠中可視化樣品
a.熒光染色 b.紫外陰影
5.記錄凝膠
a.熒光成像 b.射線自顯跡法
圖1.核酸凝膠電泳的5大關(guān)鍵步驟。
1.選擇和制備凝膠
瓊脂糖（9012-36-6）和聚丙烯酰胺（9003-05-8）是核酸分離中最常用的兩種凝膠基質(zhì)。兩種材料都是三維基質(zhì)，孔徑大小適合核酸分離，且與樣品間無反應(yīng)。可通過改變基質(zhì)的百分比來調(diào)整孔徑大小，從而有效分離不同大小的核酸。
有關(guān)瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺之間的選擇，主要取決于核酸樣品的大小和所希望達(dá)到的分辨率，雖然凝膠灌制和樣品回收的方法也可考慮（表1）。瓊脂糖凝膠的孔徑大小非常理想，可分離0.1-25 kb范圍內(nèi)的核酸分子。聚丙烯酰胺形成的孔徑較小，可用于分離小于1 kb的核酸分子。某些情況下，可采用聚丙烯酰胺凝膠以獲得片段小于100bp的單堿基分辨率[1]。
a.瓊脂糖凝膠
關(guān)于凝膠制備，瓊脂糖凝膠通常以粉末形式提供，近年來也有方便的預(yù)稱重片可供使用。為簡(jiǎn)化工作流程、節(jié)省時(shí)間，可考慮預(yù)制瓊脂糖凝膠，其在某些 市售系統(tǒng)中作為集成單元來運(yùn)行、可視化和分析。
制備您自己的瓊脂糖凝膠，凝膠比例計(jì)算為:
凝膠%(w/v)=(瓊脂糖g/緩沖液ml)x 100%
凝膠灌制時(shí)，如果使用了熒光核酸染色劑（溴化乙錠1239-45-8），可在凝膠灌制時(shí)加入推薦濃度（例如，溴化乙錠0.5 μg/mL）。
表2為不同長(zhǎng)度的DN**段分離提供了推薦的瓊脂糖凝膠百分比[2]。一般而言，較高比例的凝膠便于更小片段、更好的分離和分辨（圖2）。注意，低比例凝膠十分脆弱且難以操作，而高比例凝膠則較渾濁，且會(huì)干擾可視化。
圖2.不同百分比的瓊脂糖凝膠中DN**段的流動(dòng)性。在相同條件下（包括運(yùn)行時(shí)間），在1%、2%和3%瓊脂糖凝膠上分離出相同的DNA階梯。1kb片段用紅色星號(hào)表示，以供比較。
瓊脂糖成分
瓊脂糖是一種經(jīng)過純化的瓊脂，是海洋紅藻細(xì)胞壁的碳水化合物結(jié)構(gòu)組成部分。 瓊脂糖是一種分子量約為12萬的無支鏈（線性）聚合物，含有800-1000個(gè)單糖。 瓊脂糖鏈由一種重復(fù)的異二糖-即-D-半乳糖和3,6-酐-α-L-半乳糖通過1-4糖苷鍵結(jié)合而成。 雙糖單位，也稱瓊脂二糖，通過a-1、3連接形成了一個(gè)鏈（圖3）。
圖3.瓊脂糖的結(jié)構(gòu)單元。瓊脂糖由400-500個(gè)瓊脂二糖單位組成。
瓊脂糖溶液加熱并冷卻后，就會(huì)形成凝膠基質(zhì)。其孔洞直徑從50到200納米不等，由凝膠濃度控制。溫度高于90℃，瓊脂糖便會(huì)融化，變成無規(guī)卷曲。冷卻后，兩個(gè)瓊脂糖鏈形成由氫鍵連接的螺旋纖維。進(jìn)一步冷卻至膠凝固點(diǎn)以下（通常小于40°C），則會(huì)有更多氫鍵連接形成螺旋束網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而形成具有三維網(wǎng)格的凝膠（圖4）[3,4]。 由于氫鍵，瓊脂糖形成的凝膠加熱可逆。因此，通過溶解含有目的片段的凝膠，可提取電泳分離出的核酸。
圖4.通過加熱和冷卻改變?nèi)芤褐协傊堑慕Y(jié)構(gòu)。
對(duì)大于10kbp DNA的提取，低熔點(diǎn)（LMP）的瓊脂糖是較合適的選擇。LMP瓊脂糖在65度左右（1%的凝膠）融化—相對(duì)較低的溫度，確保可以溫和地提取凝膠中完整的核酸大分子。 LMP瓊脂糖的低凝膠溫度（~25°C）使其成為凝膠內(nèi)酶反應(yīng)的理想選擇（例如，連接）。酶在半固態(tài)的瓊脂溶液中處于活躍狀態(tài)。
b.聚丙烯酰胺凝膠
聚丙烯酰胺-丙烯酰胺和交聯(lián)劑—雙丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱為“bis”）的組分-可以粉末形式提供，但為了方便通常預(yù)先制備成原液。該粉末和液體形式是為大家所知的神經(jīng)毒素，應(yīng)使用實(shí)驗(yàn)室防護(hù)性設(shè)施，小心操作。在凝膠中，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺（以%T表示）的總濃度決定了孔隙大小—通常直徑為20-150納米。百分比越高，孔隙越小，可分辨的分子也更小。表3展示了常用的凝膠比例[2]。
核酸分離，通常采用3–30%（%T）的聚丙烯酰胺凝膠。除%T之外，雙丙烯酰胺（交聯(lián)劑）與總丙烯酰胺（%C）的重量百分比是聚丙烯酰胺凝膠孔隙大小和樣品分離的的關(guān)鍵（表4）。
%T和%C可以表示為：
%T(w/v)=[(丙烯酰胺+雙丙烯酰胺)g/緩沖液ml]x 100%
%C(w/w)=[雙丙烯酰胺g/(丙烯酰胺+雙丙烯酰胺)g]x 100%
聚丙烯酰胺的基本原理
聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺單體聚合而成的聚合物，通常與雙丙烯酰胺或N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺結(jié)合使用。交聯(lián)劑雙丙烯酰胺含有兩個(gè)單位通過亞甲基橋連的丙烯酰胺。聚合是被TEMED 催化（N,N,N′,N′-四甲基乙二胺）的自由基反應(yīng)-通常由過硫酸銨（APS）引發(fā)（圖 5）。因此，在既定溫度下，APS和/或TEMED的濃度決定了聚合速率。
圖5.丙烯酰胺形成聚丙烯酰胺，雙丙烯酰胺結(jié)構(gòu)展示。雙丙烯酰胺含有兩個(gè)單位通過亞甲基橋連的丙烯酰胺（紅色）。
c.凝膠制備中的緩沖液選擇
使用具有導(dǎo)電性的離子溶液制備瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠，確保核酸在電泳過程中具有遷移性。電泳過程中，凝膠和電泳緩沖液通常使用相同類型的緩沖液，以保持相同的pH值和離子強(qiáng)度。核酸電泳常用的兩種緩沖液為Tris-醋酸鹽EDTA （TAE）和Tris-硼酸鹽EDTA （TBE），兩者都有接近中性的pH值，有利于帶負(fù)電荷的核酸。
為分析單鏈DNA或RNA，瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠通常在變性條件下制備和運(yùn)行。變性條件會(huì)破壞核酸之間形成的氫鍵，從而減少像發(fā)夾環(huán)這樣二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。因此對(duì)RNA分離和分析而言，變性電泳更常用。瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠核酸電泳中常用的變性緩沖液包括:
瓊脂糖：磷酸鈉緩沖液中的乙二醛和DMSO、NaOH-EDTA緩沖液、MOPS緩沖液中的甲醛或甲酰胺等
聚丙烯酰胺: TBE緩沖液中的尿素
2.準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品和樣品
a.核酸標(biāo)準(zhǔn)品選擇
當(dāng)運(yùn)行凝膠時(shí)，含有已知大小的核酸參照樣品通常被稱為標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)記或 分子量標(biāo)準(zhǔn)，用于目的樣品大小的估計(jì)。 在為給定樣品選擇合適的分子量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，需考慮如下因素:
Ladde類型（例如DNA或RNA），片段結(jié)構(gòu)（例如單鏈或雙鏈），構(gòu)象（例如超螺旋、開環(huán)或線性）以確保對(duì)遷移進(jìn)行適當(dāng)比較
片段的數(shù)量和適當(dāng)?shù)姆蛛x形式，用于大小的估計(jì)
預(yù)期用途，如分子量標(biāo)準(zhǔn)是設(shè)計(jì)用于定性分析還是精確的定量測(cè)定
不同類型凝膠適用的分子量標(biāo)準(zhǔn)（例如，部分預(yù)制凝膠推薦設(shè)計(jì) 特定分子量標(biāo)準(zhǔn)以獲得最佳運(yùn)行結(jié)果）
上樣染料的性質(zhì)，避免目的條帶模糊（圖6）
上樣緩沖液與使用凝膠的兼容性（例如，緩沖液的鹽濃度會(huì)影響樣品的遷移）
早期，DNA的大小標(biāo)準(zhǔn)主要來源于病毒基因組片段(（例如,λφX174）和細(xì)菌質(zhì)粒（如pUC19）的限制內(nèi)切。該標(biāo)準(zhǔn)物在內(nèi)切、樣品純度和電泳中帶型的重現(xiàn)性方面存在問題。而后，從連接反應(yīng)和/或PCR中獲取的含有片段的分子量標(biāo)準(zhǔn)，因具有再現(xiàn)性且可產(chǎn)生預(yù)期大小的片段，而備受青睞。如今，因?yàn)樯V純化片段實(shí)現(xiàn)了質(zhì)量、帶型、強(qiáng)度和數(shù)量等方面的更高控制，被視為分子量標(biāo)準(zhǔn)黃金標(biāo)準(zhǔn)（圖6）。
圖6.DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)差異。 分子量標(biāo)準(zhǔn) #2由色譜純化的DN**段組成，存在于上佳的上樣緩沖液中，可產(chǎn)生相等或預(yù)期強(qiáng)度的條帶，并且不含有條帶污
