PUREfrex®2.1于2017年推出，與2.0的版本相比，PUREfrex®2.1可以選擇不同的還原劑，同時保留PUREfrex ®2.0反應溶液的成分，可根據需求選擇更合適的蛋白合成條件。
二硫鍵的形成對于分泌蛋白如酶或抗體的折疊和穩定性具有重要的作用。二硫鍵通常由相鄰半胱氨酸殘基的巰基(SH-)氧化形成。因此，二硫鍵的形成效率取決于氧化還原狀態。此外，能夠催化二硫鍵交換的二硫鍵異構酶也是正確配對半胱氨酸所必需的。
PUREfrex®反應混合物中的氧化還原狀態受還原劑類型以及還原劑和氧化劑比例的影響。PUREfrex 2.0的溶液I中含有二硫蘇糖醇(DTT)作為還原劑。PUREfrex 2.1的溶液I中不含還原劑，您可以為自己感興趣的蛋白質選擇合適的還原劑。PUREfrex 2.1的溶液I中既沒有DTT也沒有半胱氨酸。半胱氨酸、DTT和還原型谷胱甘肽(GSH)分別獨立包裝提供。您也可以根據實驗需求使用其他還原劑，例如2-巰基乙醇（未提供）。
圖2.PUREfrex®2.0和PUREfrex®2.1成分對比
PUREfrex®2.1使用方法：
以20ul反應體系為例，如果需要擴大體積可以等比例增加對應試劑。以下是合成含有二硫鍵的蛋白質的標準方案，合成含有二硫鍵的蛋白需要搭配DsbC Set（該套裝包含GSSG 和 DsbC），合成沒有二硫鍵的蛋白時，用DTT來代替GSH，不需要使用DsbC Set。
1. 將溶液I，Cysteine, GSH和 GSSG在室溫或37℃下加熱1分鐘至完全融解，然后在冰上冷卻。
2. 在冰上融化溶液II，溶液III和DsbC。
3. 將每種溶液渦旋后離心收集管底內容物。
4. 根據下列表格配置反應液，每1kb加入模板DNA 1-3ng/ul。（注意:在PUREfrex® 2.1中，可以自由調節還原劑(例如：Cysteine、DTT和GSH)等的量，但是一定要加Cysteine，Cysteine是合成蛋白質的原料。）
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Water |
5-X μL |
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Solution I |
8μL *1 |
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10 mM Cysteine *2 |
1μL |
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80 mM GSH *2 |
1μL |
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60 mM GSSG |
1μL |
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Solution II |
1μL |
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Solution III |
2μL |
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80 µM DsbC *3 |
1μL |
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Template DNA *4 |
X μL |
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總體積 |
20ul |
5. 在37°C的heat block或水浴中反應 2~6 h，合成蛋白。注意：蛋白質合成反應通常最長到6小時，但是一些蛋白質需要更長的孵育時間(例如24小時)以在正確的半胱氨酸殘基對之間形成二硫鍵。
6. 分析合成蛋白。
注釋：*1. 使用量與PUREfrex ® 2.0 不同。
*2. 可以自由調節還原劑（半胱氨酸、DTT和GSH等）的量，但一定要添加半胱氨酸。
*3. 使用DsbC Set中包含的稀釋緩沖液稀釋DsbC。
*4. 模板DNA的制備請參考：https://purefrex.genefrontier.com/resources/tech_notes/template-dna-preparation.html/
試劑盒組分（各溶液成分保密）：
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組分名稱 |
250 μL規格 |
2 mL x 5規格 |
組分內容 |
保存溫度 |
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Solution I |
100 μL |
800 μL x 5 |
Amino acids, NTPs, tRNAs and substrates for enzymes etc. |
-20℃ |
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Solution II |
12.5 μL |
100 μL x 5 |
Proteins in 30 % glycerol buffer |
-20℃/-80℃ |
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Solution III |
25 μL |
200 μL x 5 |
Ribosome (20 μM) |
-80℃ |
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Cysteine |
20 μL |
160 μL x 5 |
Cysteine (10 mM) |
-20℃ |
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DTT |
20 μL |
160 μL x 5 |
Dithiothreitol (40 mM) |
-20℃ |
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GSH |
20 μL |
160 μL x 5 |
Reduced glutathione (80 mM) |
-20℃ |
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DHFR DNA |
10 μL |
10 μL x 1 |
PCR product containing a gene encoding dihydrofolate reductase (DHFR) from E.coli as a positive control. (20 ng/μL) |
-20℃ |
請注意：1.上表中的保存溫度為試劑盒開封后的保存溫度，打開試劑盒之前請將試劑盒儲存在-80℃的溫度下。2.剩余的反應溶液儲存在-80℃前使用液氮或干冰/乙醇等進行速凍。請根據需求進行分裝，避免反復凍融。3. 合成DHFR時，請在20 µL合成反應溶液中添加1 µL DHFR DNA。
產品信息：
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貨號 |
名稱 |
規格 |
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GFK-PF213-0.25-EX |
PUREfrex®2.1 |
1 x 250 µl |
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GFK-PF213-2ML-EX |
2ml |
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GFK-PF213-10ML-EX |
5 x 2 ml |
當您的蛋白質需要分子伴侶的幫助或形成二硫鍵以形成正確的構象時，只需向PUREfrex®2.1中添加補充試劑即可。
分子伴侶-幫助蛋白正確折疊，合成可溶形式蛋白質
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產品貨號 |
產品名稱 |
規格 |
|
GFK-PF003-0.5-EX |
DnaK Mix |
500 µl Equivalents |
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GFK-PF003-10ML-EX |
DnaK Mix |
5 x 2 ml Equivalents |
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GFK-PF004-0.5-EX |
GroE Mix |
500 µl Equivalents |
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GFK-PF004-10ML-EX |
GroE Mix |
5 x 2 ml Equivalents |
幫助形成二硫鍵的添加物
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產品貨號 |
產品名稱 |
規格 |
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GFK-PF005-0.5-EX |
DsbC Set |
500 µl Equivalents |
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GFK-PF005-10ML-EX |
DsbC Set |
5 x 2 ml Equivalents |
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GFK-PF006-0.5-EX |
PDI Set |
500 µl Equivalents |
|
GFK-PF006-10ML-EX |
PDI Set |
5 x 2 ml Equivalents |
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