抗體應用和技術
抗體是用于各種實驗室技術的強大研究工具。在此，我們將簡要介紹最流行的實驗室技術，重點介紹它們如何使用抗體。
酶聯免疫吸附實驗(ELISA)
ELISA是一種基于平板的技術，可以檢測生物樣本中的抗原。與其他免疫測定方法一樣，ELISA依靠抗體與抗原的高度特異性相互作用來檢測目標抗原。ELISA可以對分析物和分子相互作用進行定量和定性。
在酶聯免疫吸附實驗中，抗原被直接固定在固體表面上，或者更常見的是通過捕獲抗體固定在表面上(圖1)。表面經過洗滌，然后與酶或熒光團等分子連接的檢測抗體一起孵育。
在抗原存在的情況下，這些檢測抗體會與平板保持結合，產生信號。信號的強度與樣本中的抗原濃度相對應。
圖1:夾心酶聯免疫吸附實驗裝置。多孔板上的捕獲抗體將固定感興趣的抗原。與生物素和鏈霉親和素-HRP結合的檢測抗體將識別并結合該抗原。
ELISA通常在多孔板(96孔或384孔)中進行，分析物的固定化有助于將抗原與其他樣品成分分離。這些特點使ELISA成為最容易同時對多個樣品進行檢測的方法之一。
酶聯免疫吸附法主要有四種：直接法、間接法、夾心法和競爭法，每種方法都有其獨特的優缺點和適用性。每種實驗最合適的酶聯免疫吸附實驗形式取決與許多因素，包括所需的靈敏度、特異性和檢測時間。
酶聯免疫斑點檢測
酶聯免疫斑點(ELISPOT)用于檢測細胞分泌的蛋白質，如細胞因子和生長因子。該技術可以量化和比較對各種刺激的免疫反應。
將細胞培養在96孔板中，使用抗體包被的PVDF或硝酸纖維素膜。使用一抗和共軛二抗檢測相關分泌蛋白。分泌相關蛋白的細胞會出現色斑或熒光。掃描并分析膜，量化分泌蛋白質的細胞數量或比例。
免疫印跡(WB)
免疫印跡技術廣泛應用于分離和鑒定蛋白質的研究。通過免疫印跡，我們可以檢測蛋白質，確定不同樣本之間的相對蛋白質水平，并確定目標蛋白質的分子量，從而深入了解蛋白質的翻譯后加工過程。
免疫印跡包括三個主要步驟：(1)按大小分離蛋白質，(2)將蛋白質轉移到膜上，(3)使用一抗和二抗觀察目標蛋白質(圖2)。
第一步，將蛋白質裝載到凝膠上，通過凝膠電泳按大小進行分離。然后利用電流將蛋白質條帶遷移到膜上。蛋白質轉移到膜上至關重要，因為用于電泳的凝膠為隨后的免疫染色提供了一個較差的表面，即抗體不會粘附在凝膠的蛋白質上。
最后，用特異性抗體對膜進行進一步免疫染色，并用二抗和檢測試劑對膜進行顯像。
圖2：免疫印跡簡圖
免疫沉淀(IP)和染色質免疫沉淀(ChIP)
免疫沉淀(IP)是一種分離和純化單個蛋白質和復合蛋白質的多功能技術。在這項技術中，抗體被固定在固相基質(如磁珠/瓊脂糖珠)上，從復雜的溶液中捕捉抗原。
染色質免疫沉淀(ChIP)用于確定特定蛋白質是否與體內特定DNA序列結合。通過ChIP，研究人員可以確定感興趣的蛋白質在整個基因組中結合的特定基因和系列，為了解其調控功能和機制提供重要線索。
圖3:ChIP方案工作流程。進行ChIP實驗的步驟:1.交聯，2.染色質片段化，3.免疫沉淀，4.DNA 回收和純化，5.DNA 分析。
免疫組織化學(IHC)
免疫組織化學(IHC)是一種利用抗體-抗原相互作用來檢測組織切片中抗原分布和定位的方法(圖4)。雖然定量效果不如免疫印跡或ELISA，但IHC具有在完成組織中鑒定蛋白質表達的優勢。
IHC通常用于診斷癌癥等疾病的組織異常，IHC提供了寶貴的視角和支持。
IHC染色依賴于能識別目標抗原的抗體。您可以使用顯色或熒光檢測系統來觀察抗體于抗原之間的相互作用。在色原檢測中，抗體與酶結合，當抗體接觸色原是會產生彩色沉淀。在熒光檢測中，抗體與熒光團結合。樣品制備和可視化技術多種多樣，所使用的方法應根據樣本類型和所需的靈敏度而定。
圖4:左圖為正常人扁桃體組織(福爾馬林固定石蠟包埋切片)的熒光多重IHC染色?？筆D1(橙色)、抗PDL1(綠色)、抗CD68(黃色)、抗CD3(紅色)、抗Ki67(淡藍色)和抗PanCK(灰色)的合并染色。右圖為用抗Ki67抗體對福爾馬林固定石蠟包埋的正常人扁桃體切片進行IHC染色。
免疫細胞化學(ICC)
免疫細胞化學(ICC)是利用標記抗體研究蛋白質的亞細胞分布。與IHC不同的是，這種技術側重于細胞樣本而不是組織塊。
在ICC染色中，針對相關蛋白質的抗體被應用于經過固定和通透處理的細胞培養樣本。ICC有兩種類型：直接和間接。直接ICC使用的是共軛的一抗，而間接ICC使用的是未共軛的一抗，然后用共軛的二抗進行檢測(圖5)。在大多數ICC實驗中，抗體都用熒光團標記，非常適合共定位研究。各種成像技術，如寬場顯微鏡、共聚焦顯微鏡或旋轉圓盤顯微鏡都可用于檢測信號。
圖5:左圖是用抗PDGFRA抗體(用Alexa Flour®488二抗檢測-綠色)和抗微管蛋白抗體(用Alexa Fluor®594二抗檢測-紅色)對SH-SY5Y細胞進行間接ICC染色。右圖是用共軛的抗KRT14抗體(Alexa Fluor®647-紅色)和共軛的抗微管蛋白抗體(Alexa Fluor®488-綠色)進行直接ICC檢測。細胞核用DAPI(藍色)染色。上圖顯示野生型細胞中的相關信號，下圖顯示基因敲除沒有的特定信號。圖像由共聚焦顯微鏡拍攝。
流式細胞儀和熒光激活細胞分揀
流式細胞儀是一種常用的激光技術，用于分析細胞或顆粒的特征(圖13)。該技術測量混合群體中與單個細胞結合的標記抗體發出的熒光。此外，不同細胞對光的散射也可用于確定它們的大小和特性。
圖6:流式細胞儀概覽。
通過流式細胞儀，可以分析細胞表面和細胞內分子的表達，確定異質細胞群中不同細胞類型的特征，評估分離亞群的純度，分析細胞大小和體積。它可同時對單個細胞進行多參數分析。
熒光激活細胞分揀(FACS)是流式細胞術的一種衍生技術，它根據熒光標記將細胞群物理分離成亞群。
參考文獻
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