BrdU染色方案
BrdU（溴脫氧尿苷或5-溴-2'-脫氧尿苷）是胸腺核苷的類似物，在BrdU染色實驗中用于識別增殖細胞。
BrdU可在體外對細胞系和原代細胞培養物進行標記，也可在體內對活體動物的細胞進行標記。在BrdU檢測過程中，BrdU被摻入復制的DNA中，可使用抗BrdU抗體進行檢測。
EdU染色是一種替代方法，其流程比BrdU染色更短、更簡單。
階段1 BrdU標記
BrdU標記可在體外和體內進行。有幾種方法可用于體內標記細胞，包括腹膜內注射和口服給藥。
• 體外用BrdU標記細胞
所需材料
-BrdU抗體（如Ab179916）
-可選：BrdU對照載玻片作為BrdU組織摻入的陽性對照
實驗步驟
1.將3 mg BrdU溶解于1 mL水中，制備10 mM BrdU儲備溶液。
2.用細胞培養基稀釋10 mM BrdU儲備溶液，得到10 µM BrdU標記溶液。
3.在無菌條件下，將10 µM BrdU標記溶液通過0.2 µm過濾器過濾。
4.除去細胞中現有的培養基并替換為10 µM標記溶液。
5.將細胞置于BrdU標記溶液中，在37ºC的CO2培養箱中孵育1 - 24小時。
• 提示： BrdU孵育時間取決于細胞分裂的速度。原代細胞可能需要長達24小時，而快速增殖的細胞系可能只需要1小時。應優化達到最佳信噪比所需的確切時間。
6.從細胞中除去BrdU標記溶液，并用PBS清洗兩次，每次清洗約5秒鐘。
7.再用PBS清洗三次，每次兩分鐘。
8.根據標準免疫細胞化學（ICC）方案固定和透化細胞。
• 在進行免疫染色之前，請參閱下面的DNA水解步驟。
• 通過腹膜內注射進行體內BrdU標記
所需材料
- 用PBS配置的10 mg/mL BrdU溶液
- BrdU抗體（如Ab179916）
-可選：BrdU對照載玻片作為 BrdU組織摻入的陽性對照
實驗步驟
1.將BrdU稀釋于PBS中，制成10 mg/mL的無菌溶液。
2.對于小鼠，一般來說，注射濃度為100 mg/kg的BrdU溶液。
• 提示：注射后30分鐘即可檢測到BrdU進入快速分裂的組織（如小腸）。但是，對于大多數組織，您可能需要等待長達24小時。確切的治療時間和劑量需要根據您感興趣的組織進行優化。
3.用BrdU處理后，可按照實驗室批準的程序處死動物。
4.根據標準免疫組織化學（IHC）方案固定和處理組織。
• 繼續免疫染色之前，請參閱下面的DNA水解步驟。
• 通過口服給藥進行體內BrdU標記
口服 BrdU是一種非侵入性方法，因此可用于延長BrdU給藥時間，不過由于無法控制動物的飲水量，它可能會給實驗帶來變化。
所需材料
- BrdU儲備溶液（例如10 mg/mL）
- BrdU抗體（如Ab179916）
-可選：BrdU對照載玻片作為BrdU組織摻入的陽性對照
實驗步驟
1.用飲用水將 BrdU稀釋至0.8 mg/mL。
• 注意：每天準備新鮮的并更換。
• 提示：對于小鼠，每天225 mg/kg BrdU（通過測量每只動物的飲水量計算）應可達到足夠的BrdU標記。但是，確切劑量應根據個別實驗條件進行優化。
2.用BrdU處理后，即可根據標準方案處死動物。
3.根據標準IHC實驗方案固定和處理組織。
• 然而，在免疫染色之前，請參考下面的DNA水解步驟。
第 2 階段 DNA水解
BrdU標記后，可能需要在固定和通透后進行額外的DNA水解步驟（有時稱為 DNA變性步驟），以允許抗BrdU抗體接觸DNA內的BrdU。
一些研究報告表示，也可進行熱誘導表位修復來代替HCl水解步驟，然后繼續免疫染色。
• 細胞
所需材料
-硼酸鈉緩沖液：
- 3.8 g硼酸鈉（MW=381.4）+ 100 mL蒸餾水
-用NaOH調節pH值
- 1-2.5 M 鹽酸
實驗步驟
1.室溫下將細胞放入 1 - 2.5 M HCl 中孵育10分鐘至1小時。
• 注意：應根據您的實驗優化準確的 HCl 濃度和孵育時間。
如果使用更短的孵育時間，37℃孵育可能比室溫孵育更有效。
2.可選步驟：除去HCl，并在室溫下用 0.1 M 硼酸鈉緩沖液（pH 8.5）中和30分鐘。
3.用PBS清洗三次。
4.根據標準免疫細胞化學（ICC）方案繼續進行免疫染色。
• 組織切片
• 注意：如果使用石蠟包埋切片，請確保在繼續操作之前將其脫蠟。
所需材料
-硼酸鈉緩沖液：
- 3.8 g硼酸鈉（MW=381.4）+ 100毫升蒸餾水
-用NaOH調節pH值
- 1-2 M鹽酸
實驗步驟
1.將組織切片放入1-2 M HCl中孵育30分鐘至1小時。
• 注意：應根據您的實驗優化準確的 HCl 濃度和孵育時間。
如果使用更短的孵育時間，在37℃下孵育可能比在室溫下更有效。
2.可選步驟：中和組織切片。
• 室溫下將切片放入0.1 M硼酸鈉緩沖液（pH 8.5）中孵育10分鐘。
3.用PBS清洗三次，每次清洗約5秒鐘。
4.按照標準IHC方案繼續進行免疫染色。
第 3 階段 與抗BrdU共染色（可選）
BrdU抗體可與細胞類型標記物（例如Ki67、doublecortin和 NeuN）一起使用，以識別增殖細胞和新分化的神經元。
• Ki67
Ki67 蛋白是細胞增殖的標志物，存在于周期 G1、S、G2 和 M 期的細胞中，但不存在于靜息（G0）細胞中。Ki67 抗體可代替或與BrdU結合使用來標記增殖神經元。
• 雙皮質素
未成熟神經元表達的微管相關磷蛋白。雙皮質素抗體可與BrdU結合使用，以識別未成熟的有絲分裂后神經元。
• 神經氨酸酶
NeuN是成熟神經元的標記物，可與BrdU染色結合使用來識別新分化的神經元。
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