血管新生（Angiogenesis），又稱為血管生成或血管發生，是指在原先存在的血管的基礎上生出新的血管的生理學過程，血管新生主要存在于內皮細胞的分裂和增殖種，血管新生有多少種檢測方法？以下是從一篇文獻中找到的31種檢測方法。

以下是兩種常用的血管新生的實驗檢測操作步驟：
1.MTT法檢測內皮細胞活性
貼壁細胞
1.收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入 100ul,鋪板使待測細胞調密度至 1000-10000 孔，（邊緣 孔用無菌 PBS 填充）。
2.5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96 孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后 即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般 5-7 個梯度,每孔 100ul,設 3-5 個復孔.建議設 5 個，否則難以反應真實情況 。
3.5%CO2，37℃孵育 16-48 小時，倒置顯微鏡下觀察。
4.每孔加入 20ulMTT 溶液（5mg/ml，即 0.5%MTT），繼續培養 4h。若藥物與 MTT 能夠反應，可先離心后 棄去培養液，小心用 PBS 沖 2-3 遍后，再加入含 MTT 的培養液。
5.終止培養，小心吸去孔內培養液。
6.每孔加入 150ul 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩 10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀 OD490nm 處測量各孔的吸光值。
7.同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、 MTT、二甲基亞砜）。
懸浮細胞：
1.收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度 1×106/ml，按次序將
①補足的 1640（無血清）培養基 40ul ；
② 加 Actinomycin D（有毒性）10ul 用培養液稀釋 l?g/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；
③需檢測物 10ul；
④細胞懸液 50ul（即 5×104cell/孔），共 100ul 加入到 96 孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加 100?(儲 存液 100 1640）。
2.置 37℃，5%CO2 孵育 16-48 小時，倒置顯微鏡下觀察。
3.每孔加入 10 ul MTT 溶液（5 mg/ml，即 0.5%MTT），繼續培養 4 h。（懸浮細胞推薦使用 WST-1，培養 4 h 后可跳過步驟 4），直接酶聯免疫檢測儀 OD570nm（630nm 校準）測量各孔的吸光值）。
4.離心（1000 轉 x10min），小心吸掉上清，每孔加入 100 ul 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩 10 min，使 結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀 OD570nm（630nm 校準）測量各孔的吸光值。
5.同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、 MTT、二甲基亞砜），每組設定 3 復孔。
二、內皮細胞的成管實驗操作步驟：以HUVEC細胞為例
提前預冷分裝基質膠所需要的耗材，在冰上4°C 解凍基底膜基質，解凍后使用酒精擦拭消毒，置于冰上分裝或者操作，使用前搖勻。
A. 從靶細胞系制備條件培養基
1. 為了制備條件培養基（CM），接種靶細胞并生長至30-40%匯合（取決于細胞系的生長速率），用無血清DMEM（例如，對于T75組織培養瓶為10ml；抗生素的存在與否無關緊要）
2. 代替生長培養基24小時，然后當細胞在T75組織培養瓶中達到60-80%匯合時收獲CM。
如果收集CM后未立即使用，則取0.5 ml CM等分試樣，并在-80°C下儲存。

B.人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）細胞的制備

1. 按照培養基配比要求配好ECGM完全培養基。

2. 根據需要將HUVEC細胞接種在T25或T75培養瓶中，使其達到70-80%的融合。

3. 在不含抗生素的培養基200PRF中進行試管形成測定之前，去除血清使HUVEC細胞饑餓3-6小時（例如，對于T25組織培養瓶為5毫升）。

注：在血清饑餓結束時，轉至程序C步驟1。

4. 在用生長因子減少的基質膠涂布96孔板后，用胰蛋白酶從燒瓶表面去除細胞，用DMEM與血清中和，在室溫下以1200rpm（276xg）離心3分鐘使細胞沉淀，重懸于2-3ml無血清DMEM中，通過計數細胞來測定HUVEC的濃度，并通過向上和向下吸移幾次以4×105/ml無血清DMEM重懸HUVEC細胞，以確保均勻的單細胞懸浮液。

注：對于生長因子減少的基質膠，應盡可能減少解凍/冷凍周期。

5. 在將500μl HUVEC細胞懸浮液移液到1.5 ml試管中的同時充分混合。使用臺式離心機以4000rpm（1100rcf）的轉速將細胞降速3分鐘。在不干擾細胞沉淀的情況下小心地吸出上清液。盡可能多地去除上清液。根據要使用的靶細胞系的數量，在1.5ml試管中制備適當數量的HUVEC細胞。

注：每個靶細胞系CM將懸浮一管HUVEC，每個懸浮的HUVEC將分配3個一式三份的孔。因此，每個靶細胞系總共將使用3個孔。

6. 解凍從程序a步驟2收集的0.5ml等分的目標細胞系CM，并用胎牛血清將其補充至1%的最終濃度，以在程序B步驟5中重懸HUVEC細胞顆粒。

注：每個靶細胞系應一式三份（每個孔需要100μl HUVEC細胞懸浮液）。

C . 用生長因子減少的基質膠（啟達生物，貨號SD0054）涂覆96孔板

1. 使用前一天在4°C下解凍適當體積的基質膠。

2. 將96孔板和移液管尖端在-20°C下預冷2-3小時。

3. 在HUVEC細胞血清饑餓接近尾聲時，在計數HUVEC之前，在冰上預冷96孔板的每孔中，等分試樣50μl的基質膠。旋轉鋪板，直到凝膠均勻地分布在整個孔上。避免氣泡的形成是非常重要的。使其在室溫下在水平表面上聚合1小時。

D. 將HUVEC細胞分配到涂布的96孔板上

1. 將100μl程序B步驟6中獲得的HUVEC細胞懸浮液完全混合到96孔板的標記孔中。將平板在37°C、5%CO2下培養4-6小時。

2. 用光學顯微鏡觀察細胞。拍攝毛細管網絡的圖像，并使用Scion Image軟件計算管道長度。

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