蛋白質(zhì)印跡的上樣對(duì)照
自從1979年第一篇描述蛋白質(zhì)印跡的出版物以來，這種免疫檢測技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于事變從細(xì)胞或組織中提取的復(fù)雜混合物中的特定蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)印跡具有三個(gè)基本要素：1按大小分離蛋白質(zhì)，2轉(zhuǎn)移到固相支持物上，3使用適當(dāng)?shù)囊豢箻?biāo)記目標(biāo)蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行可視化（通常使用偶聯(lián)的二抗）。隨后工具和技術(shù)的改進(jìn)，以及高靈敏度熒光標(biāo)記的開發(fā)，有效地提高了檢測極限，并使科學(xué)家能夠探測組織特異性的正常和疾病。然而，科學(xué)家在使用定量蛋白質(zhì)印跡法來識(shí)別蛋白質(zhì)水平的變化時(shí)通常會(huì)遇到一些困難。這是由于許多蛋白質(zhì)在不用組織和不同生理和病理?xiàng)l件下表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。
蛋白質(zhì)印跡：一項(xiàng)并不簡單的常規(guī)技術(shù)
盡管蛋白質(zhì)印跡可能是最常用的免疫應(yīng)用，單仍然存在一些可能長期被忽視的關(guān)鍵技術(shù)問題。例如，分離或分離方案是否會(huì)影響蛋白質(zhì)或其翻譯后修飾的完整性？能否區(qū)分蛋白質(zhì)的講解或聚集以及生物過程的相關(guān)產(chǎn)物？當(dāng)結(jié)果是多個(gè)條帶時(shí)，如何確定哪些是結(jié)果、變異、偽影？
定量蛋白質(zhì)印跡可用于比較一組樣品中靶蛋白的相對(duì)量，所述樣品可代表不同的個(gè)體、治療條件、疾病狀態(tài)或其他生物學(xué)變量。為了準(zhǔn)確識(shí)別和測量多個(gè)樣品的總蛋白水平，科學(xué)家可以使用“上揚(yáng)對(duì)照”作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。該對(duì)照是指添加針對(duì)假定存在于所有樣品中的蛋白質(zhì)的一抗，并且其相對(duì)豐度不受到生物變異或?qū)嶒?yàn)條件的影響。蛋白質(zhì)靶標(biāo)通常是上樣對(duì)照的良好候選者，它們是普遍表達(dá)的“管家”基因產(chǎn)物。假設(shè)不同樣品泳道之間的上樣對(duì)照相同，使用上樣對(duì)照可以對(duì)所有孔中的樣品上樣進(jìn)行定量，以使結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。使用上樣對(duì)照還可以防止“邊緣效應(yīng)”，這是使用大量泳道時(shí)常見的情況，并且外側(cè)泳道中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到抹上更靠近框架的位置，從而導(dǎo)致在泳道上產(chǎn)生更強(qiáng)烈的染色。上樣對(duì)照可用于顯示蛋白質(zhì)上樣量是否發(fā)生變化，并可解釋觀察到的目標(biāo)條帶的變化。如果正確使用，上樣對(duì)照可確保蛋白質(zhì)得到正確定量，盡管蛋白質(zhì)印跡所有泳道上的上樣量存在細(xì)微差異。
選擇上樣對(duì)照抗體
β-肌動(dòng)蛋白和β-微管蛋白一直被用作加載對(duì)照，因?yàn)樗鼈兊谋磉_(dá)在大多數(shù)模型系統(tǒng)中是相對(duì)組成型的。然而，一些出版刊物質(zhì)疑使用β-肌動(dòng)蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)負(fù)荷對(duì)照，理由是β-肌動(dòng)蛋白和β-微管蛋白水平組織之間存在差異，并且它們的表達(dá)可能受到病理?xiàng)l件的影響。這些作者建議將總蛋白分析作為定量蛋白印跡中的替代技術(shù)，并建議在研究所研究基因的表達(dá)模式后應(yīng)謹(jǐn)慎使用“管家”基因產(chǎn)品。盡管如此，β-肌動(dòng)蛋白和β-微管蛋白作為內(nèi)參抗體還是具有一定的優(yōu)勢：它們高度保守，表達(dá)水平高，在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)條件下表現(xiàn)出較好穩(wěn)定性。值得注意的是，必須根據(jù)所研究的特定組織或細(xì)胞類型選擇對(duì)照，并且可能需要進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)測試來驗(yàn)證上樣對(duì)照的均勻性。
通過上樣對(duì)照抗體獲得有效結(jié)果的技巧
為了克服蛋白質(zhì)印跡的變異性并減少數(shù)據(jù)解釋中的錯(cuò)誤，以下一些預(yù)防措施可能會(huì)有所幫助。
使用穩(wěn)定表達(dá)且受實(shí)驗(yàn)條件影響最小的內(nèi)部上樣對(duì)照。
選擇針對(duì)已知在樣品中組成行表達(dá)的蛋白質(zhì)的上樣對(duì)照抗體。
利用第二個(gè)上樣對(duì)照來證實(shí)第一個(gè)對(duì)照獲得的結(jié)果。對(duì)于新的或新穎的樣品來說，可能特別有價(jià)值。
上樣對(duì)照應(yīng)涵蓋較寬的分子量范圍，以便選擇的對(duì)照與目標(biāo)蛋白的分子量相似。這確保了可以在印跡上輕松的區(qū)分目標(biāo)條帶和對(duì)照條帶。
上樣對(duì)照抗體通常檢測大量表達(dá)的管家蛋白，導(dǎo)致信號(hào)飽和，特別是在使用化學(xué)發(fā)光檢測方法時(shí)，過飽和可能會(huì)導(dǎo)致上樣對(duì)照條帶無法用于參考，可能會(huì)隱藏目標(biāo)蛋白質(zhì)量的樣品間差異。
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