蛋白質印跡的上樣對照
自從1979年第一篇描述蛋白質印跡的出版物以來，這種免疫檢測技術已經被廣泛用于事變從細胞或組織中提取的復雜混合物中的特定蛋白質。蛋白質印跡具有三個基本要素：1按大小分離蛋白質，2轉移到固相支持物上，3使用適當的一抗標記目標蛋白質，然后進行可視化（通常使用偶聯的二抗）。隨后工具和技術的改進，以及高靈敏度熒光標記的開發，有效地提高了檢測極限，并使科學家能夠探測組織特異性的正常和疾病。然而，科學家在使用定量蛋白質印跡法來識別蛋白質水平的變化時通常會遇到一些困難。這是由于許多蛋白質在不用組織和不同生理和病理條件下表現出不同的表達模式。
蛋白質印跡：一項并不簡單的常規技術
盡管蛋白質印跡可能是最常用的免疫應用，單仍然存在一些可能長期被忽視的關鍵技術問題。例如，分離或分離方案是否會影響蛋白質或其翻譯后修飾的完整性？能否區分蛋白質的講解或聚集以及生物過程的相關產物？當結果是多個條帶時，如何確定哪些是結果、變異、偽影？
定量蛋白質印跡可用于比較一組樣品中靶蛋白的相對量，所述樣品可代表不同的個體、治療條件、疾病狀態或其他生物學變量。為了準確識別和測量多個樣品的總蛋白水平，科學家可以使用“上揚對照”作為內部標準。該對照是指添加針對假定存在于所有樣品中的蛋白質的一抗，并且其相對豐度不受到生物變異或實驗條件的影響。蛋白質靶標通常是上樣對照的良好候選者，它們是普遍表達的“管家”基因產物。假設不同樣品泳道之間的上樣對照相同，使用上樣對照可以對所有孔中的樣品上樣進行定量，以使結果標準化。使用上樣對照還可以防止“邊緣效應”，這是使用大量泳道時常見的情況，并且外側泳道中的蛋白質轉移到抹上更靠近框架的位置，從而導致在泳道上產生更強烈的染色。上樣對照可用于顯示蛋白質上樣量是否發生變化，并可解釋觀察到的目標條帶的變化。如果正確使用，上樣對照可確保蛋白質得到正確定量，盡管蛋白質印跡所有泳道上的上樣量存在細微差異。
選擇上樣對照抗體
β-肌動蛋白和β-微管蛋白一直被用作加載對照，因為它們的表達在大多數模型系統中是相對組成型的。然而，一些出版刊物質疑使用β-肌動蛋白作為標準負荷對照，理由是β-肌動蛋白和β-微管蛋白水平組織之間存在差異，并且它們的表達可能受到病理條件的影響。這些作者建議將總蛋白分析作為定量蛋白印跡中的替代技術，并建議在研究所研究基因的表達模式后應謹慎使用“管家”基因產品。盡管如此，β-肌動蛋白和β-微管蛋白作為內參抗體還是具有一定的優勢：它們高度保守，表達水平高，在大多數實驗條件下表現出較好穩定性。值得注意的是，必須根據所研究的特定組織或細胞類型選擇對照，并且可能需要進行經驗測試來驗證上樣對照的均勻性。
通過上樣對照抗體獲得有效結果的技巧
為了克服蛋白質印跡的變異性并減少數據解釋中的錯誤，以下一些預防措施可能會有所幫助。
使用穩定表達且受實驗條件影響最小的內部上樣對照。
選擇針對已知在樣品中組成行表達的蛋白質的上樣對照抗體。
利用第二個上樣對照來證實第一個對照獲得的結果。對于新的或新穎的樣品來說，可能特別有價值。
上樣對照應涵蓋較寬的分子量范圍，以便選擇的對照與目標蛋白的分子量相似。這確保了可以在印跡上輕松的區分目標條帶和對照條帶。
上樣對照抗體通常檢測大量表達的管家蛋白，導致信號飽和，特別是在使用化學發光檢測方法時，過飽和可能會導致上樣對照條帶無法用于參考，可能會隱藏目標蛋白質量的樣品間差異。
參考文獻
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