N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸 ,99%

P394623

蛋白質L瓊脂糖

R488105

RIPA 緩沖液 ,

R355028

ReadytouseTM PBS速溶顆粒（pH 7.4） ,

R394624

重組蛋白G瓊脂糖 ,

S301560

氯化鈉溶液 ,5mol/L

T434565

Triton? X-102 ,

M301574

β-巰基乙醇 ,分子生物學，用于電泳，細胞培養，99%

免疫沉淀簡介

免疫沉淀（IP）是應用最廣泛的免疫化學技術之一。免疫沉淀，然后是SDS-PAGE和免疫印跡，通常用于各種應用，例如：確定蛋白質抗原的分子量，研究蛋白質間相互作用，確定特異性酶活性，監測蛋白質翻譯后修飾，并確定蛋白質的存在和數量。IP技術還能夠檢測稀有蛋白質，否則很難檢測，因為它們可以通過免疫沉淀濃縮到1×104倍。

在IP方法中，來自細胞或組織勻漿的蛋白質通過免疫復合物在適當的裂解緩沖液中沉淀，所述免疫復合物包括抗原（蛋白質）、第一抗體和蛋白質A-、G-或L-蔗糖綴合物或第二抗體瓊脂糖綴合物。瓊脂糖綴合物的選擇取決于初級抗體的物種來源和同種型。所描述的方法是可比較的，并且方法的選擇取決于特異性抗原抗體系統。

試劑和設備

1.瓊脂糖綴合物：固定在Sepharose?CL-4B（產品編號P405880）或G蛋白瓊脂糖4B（產品編號R394624）或L蛋白瓊脂糖（產品編號P394623）上的A蛋白，或抗體-瓊脂糖綴合體（根據第一抗體的物種來源和同種型的第二抗體綴合物）

2.細胞或組織裂解物制備

3.免疫沉淀一級抗體和非相關抗體（陰性對照）

4.SDS-PAGE和免疫印跡試劑及設備

5.HNTG緩沖液：20mM HEPES緩沖液，pH 7.5（產品編號H109406），含有150mM NaCl（產品編號S301560）、0.1%（w/v）Triton X-100（產品編號T434565）和10%（w/v）甘油（產品編號G424796）

6.洗滌緩沖液（冰冷）：HNTG緩沖液，或PBS pH 7.4（產品編號R355028），或根據所需洗滌嚴格程度的其他緩沖液（RIPA緩沖液 產品編號 R488105）

7.具有或不具有2-巰基乙醇（2-ME（產品編號M301574））的萊姆利樣品緩沖液（例如1x、2x或3x）

8.微型離心管

9.微型離心機和振動篩

免疫步驟

特異性抗原的免疫沉淀

注意：除非另有說明，否則在冰上使用微型離心管執行所有IP步驟。

用洗滌緩沖液洗滌瓊脂糖綴合物兩次，在室溫下以12000xg離心10秒，丟棄上清液。

注意：如果瓊脂糖綴合物是粉末，則用去離子H2O將其重建，并使其膨脹5分鐘。

在洗滌緩沖液（50%懸浮液）中重新懸浮瓊脂糖綴合物。

根據需要，繼續使用方法A或方法B。

方法A

1.在微量離心管中將瓊脂糖綴合物分成50-100μL（約25-50μL瓊脂糖/床體積）的等分試樣。

2.在每根試管中加入10μL適當稀釋的初級抗體。

3.在室溫下培養15-60分鐘，在合適的搖壺上輕輕混合樣品。

4.在4°C下以3000xg離心2分鐘，丟棄上清液。

5.用1mL洗滌緩沖液洗滌每個樣品，在4°C下以3000xg離心2分鐘，重復此步驟至少兩次。

6.向每根試管中加入0.1-1.0 mL的細胞裂解物。

7.在4°C下培養90分鐘至過夜，在合適的搖壺上輕輕混合樣品。

8.通過在4°C下以3000xg離心2分鐘來收集免疫沉淀的復合物，丟棄上清液。

9.用1 mL洗滌緩沖液洗滌顆粒，在4°C下以3000xg離心2分鐘。重復此步驟至少3次。

方法B

1.向細胞裂解物樣品（0.1-1.0 mL）中加入10μL適當稀釋的抗體（參考產品規范）。

2.在4°C下培養90分鐘至過夜，在合適的搖壺上輕輕混合樣品。

3.加入50-100μL瓊脂糖綴合物懸浮液（約25-50μL瓊脂糖/床體積）。

4.在4°C下培養15-60分鐘，用搖壺輕輕混合樣品。

5.通過在4°C下以3000xg離心2分鐘來收集免疫沉淀的復合物，丟棄上清液。

6.通過重懸浮和在4°C下以3000xg離心2分鐘，用1ml洗滌緩沖液洗滌顆粒。重復此步驟至少3次。

SDS-PAGE的制備

1.將每個顆粒重新懸浮在25-100μL萊姆利樣品緩沖液中，最終濃度為1x樣品緩沖液，將樣品在95°C下加熱5分鐘。

2.在室溫下以12000xg離心30秒。收集上清液（IP樣品）。如果需要，（在蛋白質穩定性允許的情況下）IP樣品可以儲存在-70°C的樣品緩沖液中。

3.在SDS-PAGE上運行已知濃度的樣品和MW標準品（聚丙烯酰胺凝膠的適當百分比取決于蛋白質的分子大小）。

4.轉移到硝化纖維上，進行免疫印跡。

免疫沉淀（IP）的常見問題及解答

1. 用于一般免染的抗體是否都可以用作免疫沉淀實驗？

答：抗體的性質對免疫沉淀實驗影響很大?？贵w不同，和抗原以及Protein G或Protein A的結合能力也就不同。所以一般免染能結合的抗體未必能用于IP反應。一般來說，多抗是沉淀反應最好的選擇。另外，純化的單抗、腹水和雜交瘤上清液也可用于免疫沉淀。

2. 為什么溶解抗原的緩沖液中要加入一定量的蛋白酶抑制劑？

答：從活性細胞裂解出來的樣品中，往往含有一定量的蛋白酶。為防止預檢測蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，并且在低溫下進行實驗。

3. 溶解抗原的緩沖液的配制需要注意什么？

答：多數的抗原是細胞構成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強表面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結合。另一面，如用弱表面活性劑溶解細胞，就不能充分溶解細胞蛋白。即便溶解也產生與其它的蛋白結合的結果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結合。

4. 免疫沉淀實驗應如何把握抗體和緩沖液的比例？

答：每次沉淀實驗之前，考慮抗體/緩沖液的比例十分重要?？贵w過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清；緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。具體比例視具體情況而定。

5. 免疫沉淀應該如何配制細胞裂解液？

答：適當的細胞裂解液的選擇取決于所要研究蛋白的特性。TritonX-100,NP40是非離子界面活性劑，作用溫和；DOC(sodium de-oxycholate)，SDS是離子性的強活性劑。所以裂解液的配制時所用去污劑的種類和濃度以及鹽濃度等條件需實驗者進行優化。注意如果忘記加TritonX-100，只加DOC或SDS，可能使抗體完全失去活性。

參考文獻

[1] Harlow E, Lane D. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual. Laboratory Press New York: Cold Spring Harbor.

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