免疫沉淀(IP)裂解液和試劑
免疫沉淀是一種能夠純化蛋白質(zhì)的方法。將目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體與細(xì)胞提取物一起孵育，抗體會(huì)與溶液中的蛋白質(zhì)結(jié)合。通過使用蛋白A/G偶聯(lián)的瓊脂糖珠將抗體/抗原復(fù)合物從樣品中提取出來 。這可以將目標(biāo)蛋白質(zhì)與樣品的其余部分分離。然后通過SDS-PAGE分離樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。
裂解緩沖液
理想的裂解緩沖液將最大限度地減少蛋白質(zhì)變性，同時(shí)從樣品中釋放足夠量的蛋白質(zhì)。NP-40和Triton X-100等非離子型去污劑的刺激性低于SDS和脫氧膽酸鈉等離子型去污劑。其他可能影響免疫沉淀成功的變量包括了鹽濃度、二價(jià)陽離子濃度和pH值等。為了優(yōu)化變量，應(yīng)在以下范圍內(nèi)測試它們：
-鹽：0-1 M
-非離子洗滌劑：0.1-2%
-離子洗滌劑：0.01-0.5%
-二價(jià)陽離子：0-10 mM
-EDTA：0-5 mM
-酸堿度：6-9
非變性裂解緩沖液
用于可溶于去污劑且可被抗體以天然形式識別的抗原。Triton X-100可以替代NP-40。
-20 mM Tris HCl pH 8
-137 mM 氯化鈉
-1% Nonidet P-40 (NP-40)
-2 mM EDTA
4°C下最多可保存6個(gè)月，使用前立即添加蛋白酶抑制劑。
為方便起見可配制10%脫氧膽酸鈉儲備液(5g加入50mL)，必須避光。
不含去垢劑的可溶性蛋白裂解緩沖液
一些可溶性蛋白質(zhì)可能不需要使用洗滌劑。此緩沖液用于機(jī)械細(xì)胞裂解，例如使用杜恩斯勻漿器進(jìn)行勻漿。
PBS含有：
-5mM EDTA
-0.02%疊氮化鈉
4°C下最多可保存6個(gè)月，使用前立即添加蛋白酶抑制劑。
非去污劑可溶性抗原的變性裂解緩沖液
僅識別變性蛋白質(zhì)的抗體無法接近天然蛋白質(zhì)的表位。收獲和裂解細(xì)胞時(shí)，在變性裂解緩沖液中加熱細(xì)胞。該方法也可用于無法用非離子去污劑從細(xì)胞中提取的抗原。使用蛋白酶抑制劑將有助于從染色質(zhì)中提取蛋白質(zhì)。
1% SDS
5mM EDTA
室溫下最多可保存1周。
使用前立即添加
蛋白酶抑制劑15 U/mL
洗滌緩沖液
-10mM Tris;調(diào)節(jié)pH至7.4
-1mM EDTA
-1mM EGTA；pH8.0
-150mM氯化鈉
-1% Triton X-100
-0.2mM原釩酸鈉
4°C下最多可保存6個(gè)月。使用前立即添加蛋白酶抑制劑。
其他試劑
蛋白酶抑制劑
細(xì)胞裂解后，蛋白水解、去磷酸化和變性過程就開始了。將樣品放在冰上會(huì)減慢這些過程，但也可以使用蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物。如果不使用混合物，PMSF(50 μg/mL)和抑肽酶(1 μg/mL)是常用于免疫沉淀的蛋白酶抑制劑。
其他試劑
-無菌PBS pH 7.4
-無菌PBS-BSA 1% w/v(過濾)
-TBST緩沖液
-用于蛋白質(zhì)印跡的上樣/樣品緩沖液
-VeriBlot用于免疫沉淀二抗，在蛋白質(zhì)印跡過程中優(yōu)先檢測未還原、未變性 的一抗。
-100mM EDTA庫存溶液由1.86gEDTA溶解在40mL H2O中制成。添加NaOH 將pH調(diào)節(jié)至7.4。最后將總體積調(diào)整至50 mL。
制備裂解物
細(xì)胞培養(yǎng)物裂解物(非變性)
1，將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于冰上，并用冰冷的PBS清洗細(xì)胞。
2，排干PBS，然后添加冰冷的裂解緩沖液(1mL每107個(gè)細(xì)胞/100mm2培養(yǎng)皿 /150cm2燒瓶；0.5 mL每5×106個(gè)細(xì)胞/60mm2培養(yǎng)皿或75cm2燒瓶)。
3，使用冷塑料細(xì)胞刮刀將貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)皿上刮下，然后將細(xì)胞懸浮液輕輕轉(zhuǎn) 移至預(yù)冷的微量離心管中。
4，在4°C下保持恒定攪拌30分鐘。
5，在4°C的微量離心機(jī)中離心。
您可能需要根據(jù)細(xì)胞類型改變離心力和時(shí)間。原則是12,000 rpm，20分鐘， 但您應(yīng)該針對您的特定實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化(例如，白細(xì)胞需要非常輕微的離心)。
6，輕輕地從離心機(jī)中取出管子并置于冰上。吸出上清液并置于冰上的新管中， 并丟棄沉淀。
細(xì)胞培養(yǎng)物裂解物(變性)
1，將100μL變性裂解緩沖液添加到0.5-2×107個(gè)細(xì)胞中。
2，以最大速度劇烈渦旋2-3秒充分混合。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至微量離心管中。由 于DNA的釋放，溶液在此階段可能會(huì)變得粘稠。
3，將樣品加熱至95°C，5分鐘使其變性。
4，用0.9 mL非變性裂解緩沖液稀釋懸浮液，輕輕混合。
非變性裂解緩沖液中過量1% Triton X-100會(huì)淬滅原始變性緩沖液中的SDS。
5，將裂解的懸浮液通過連接到1 mL注射器的針頭5-10次，從而打碎DNA。
通過重復(fù)機(jī)械破壞，直到粘度降低。如果 DNA存在未完全消化和片段化， 可能會(huì)干擾離心后沉淀與上清液的分離。
6，在冰上孵育5分鐘。
7，繼續(xù)進(jìn)行免疫沉淀。
組織裂解物
1，用干凈的工具盡快解剖組織。如果可能，請?jiān)诒线M(jìn)行以防止蛋白酶降解。
2，將組織放入圓底微量離心管中，浸入液氮中快速冷凍。將樣品儲存在-80°C 下供以后使用或保存在冰上以便立即均質(zhì)化。
3，對于約5 mg的組織片，將約300 μL裂解緩沖液快速添加到管中，并用電動(dòng) 勻漿器勻漿。
4，每次沖洗時(shí)用另外300 μL裂解緩沖液沖洗刀片兩次，然后在4°C下保持恒 定攪拌2小時(shí)(例如置于冰箱中的定軌搖床上)。
裂解緩沖液的體積必須根據(jù)存在的組織量來確定。蛋白質(zhì)提取物不應(yīng)太稀，以避免蛋白質(zhì)損失并盡量減少上樣到凝膠上的樣品體積。最低濃度0.1mg/mL；最佳濃度為1–5mg/mL。
如果需要變性樣品，使用變性裂解緩沖液并執(zhí)行上述變性方案中的步驟2-5。
5，在微量離心機(jī)中于4°C下以12,000 rpm離心20分鐘。輕輕地將管從離心機(jī) 中取出并置于冰上，吸出上清液并置于冰上保存的新管中丟棄沉淀。
預(yù)清除裂解物
預(yù)清除裂解物有助于減少非特異性結(jié)合并降低背景。但如果蛋白質(zhì)的最終檢測是通過蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行，則不需要預(yù)清除，除非污染蛋白質(zhì)干擾了目標(biāo)蛋白質(zhì)的可視化。
1，將50 μL與免疫沉淀抗體相同種類和同種型的脫靶抗體或正常血清(通常首 選兔)添加到1 mL裂解液中。在冰上孵育1小時(shí)。
2，將100 μL珠漿添加到裂解液中。
3，在 4°C下孵育10–30分鐘，并輕輕攪拌。
4，在微量離心機(jī)中于4°C以14,000 g旋轉(zhuǎn)10分鐘。
5，丟棄珠粒并保留上清液用于免疫沉淀。
為了提高產(chǎn)量，可以在裂解緩沖液中將珠子洗滌1或2次以上，并將上清液 收集在一起。
重要的是要確保盡可能多地去除正常血清。為了確保這一點(diǎn)，可以使用裂解緩沖液代替樣品進(jìn)行測試，并執(zhí)行上述所有預(yù)清除步驟。
將所得上清液進(jìn)行凝膠電泳并用考馬斯染色顯示血清Ig是否被有效去除。如果血清未充分去除，重鏈和輕鏈將出現(xiàn)50和25kDa的條帶；它的存在可能會(huì)導(dǎo)致免疫沉淀反應(yīng)較弱。考慮減少血清量或增加預(yù)澄清步驟中與樣品一起孵育的珠子量。?
參考文獻(xiàn)
1.Bonifacino, Juan S. et al. Current Protocols in Immunology 8.3.1 -8.3.28, New York: John Wiley, 2001.
2.Harlow, Ed, and David Lane. Using Antibodies. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.