單克隆抗體生產技術于1975年由K?hler和Milstein發明。作為功能分子的單克隆抗體不僅可用于基礎科學，還可用于藥物、測試藥物、生物傳感器等領域。近年來，以單抗為主的藥物在中小藥品銷售中占主導地位，預計到2023年底，市場收入將達到2189.7億美元左右。
單克隆抗體有兩種類型：一種是識別初級蛋白結構的線性表位的抗體，另一種是識別二級、三級和更高結構的抗體。在生命科學研究中，使用識別線性表位的抗體包括ELISA和Western blot方法。然而，使用這類抗體的應用有限，而結構識別抗體有廣泛的應用，如免疫沉淀，免疫染色等。
實驗流程簡圖
單克隆抗體是由一個產生抗體的細胞與一個骨髓瘤細胞融合而形成的雜交廇細胞經無性繁殖而來的細胞群所產生的，所以它的免疫球蛋白屬同一類型，質地純一，而且它是針對某一抗原決定簇的，因此特異性強，親合性也一致。
一、免疫鼠的制備?
可溶性抗原的免疫原性較弱，一般需要通過添加佐劑來提高免疫效果。佐劑可以先于抗原或與抗原混合后注入動物機體內來增強抗原免疫原性，同時可以延緩抗原在體內的降解以及增強免疫應答。
常用的佐劑有弗氏佐劑、鋁佐劑、水溶性佐劑等。一般情況下，免疫效果會因為小鼠個體差異和實驗人員的操作而存在偏差，所以一般選擇同時免疫多只小鼠進行實驗。
備注：
本文將主要闡述弗氏佐劑和水溶性佐劑的兩種免疫方法。
1.1 實驗用材料
1.1.1 實驗動物
免疫鼠制備時通常選用6-8周齡的Balb/c雌鼠。所有實驗動物均需皮毛光亮，精神狀態良好；維持21～27℃的恒溫飼養且每日提供光照/黑暗環境12/12h循環。
1.1.2 主要試劑
1、弗氏佐劑
2、QuickAntibody-Mouse 5W 水溶性佐劑
1.2 方法
1.2.1 免疫鼠的制備
1.2.1.1 方法一：傳統免疫法
弗氏不完全佐劑由礦物油（石蠟油）、乳化劑（羊毛脂）組成；弗氏完全佐劑額外添加了卡介苗或殺死的分枝桿菌。免疫時將弗氏佐劑與抗原按體積比 1：1混合，完全乳化形成油包水結構后即可用于免疫注射。
備注：
注意低溫操作，以防摩擦產生的熱量導致部分抗原失活。
1.2.1.2 方法二：水溶性佐劑免疫
用生理鹽水將抗原稀釋到 2 倍最終濃度，無菌條件下將水溶性佐劑QuickAntibody-Mouse 5W與抗原按體積比 1：1 迅速上下顛倒混勻，兩條后小腿肌肉注射免疫小鼠，每只小鼠注射 100μl體積。
備注：
使用前應充分混勻佐劑，與抗原混合后產生沉淀屬正常現象，抽入針管后應盡快注射，建議整體實驗流程控制在10min之內。
1.2.2 尾尖血測效價
1、最后一次免疫小鼠間隔2周后，取各免疫鼠尾尖血100～200μl，12000rpm，4℃，離心15min取上層血清，梯度稀釋后用間接ELISA法檢測血清內的抗體效價；
2、根據ELISA結果選擇血清抗體效價較高的1~2只小鼠于融合實驗前3天進行沖擊免疫，采取腹腔注射抗原溶液。
備注：
1、若免疫效果不理想可以再通過腹腔注射（傳統免疫法）或后小腿肌肉注射（水溶性佐劑法）再次免疫，間隔2~3周后重復檢測血清抗體效價；
2、沖擊免疫可能會造成小鼠死亡，因此建議選擇~2只小鼠同時進行沖擊免疫。
二、雜交瘤細胞融合?
正常小鼠通過免疫抗原的長期刺激，脾臟內的B淋巴細胞（漿細胞）可以產生針對于抗原的特異性抗體，但B細胞不具備在體外長期存活的能力。為了獲取在體外可以長期生存，并且具有產生抗體能力的細胞，早期人們通過實驗發現將免疫鼠的脾細胞與可無限培養的小鼠骨髓瘤細胞進行融合后可以獲得既可以分泌特異性抗體，又具有無限增殖能力的雜交瘤細胞。
2.1 實驗用材料
2.1.1 實驗動物及細胞
用于細胞融合實驗的是與免疫動物屬于同一品系的SP2/0骨髓瘤細胞，這樣細胞融合效率較高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內產生富含大量單克隆抗體的腹水。
2.1.2 主要試劑
1、50%PEG1450即用型溶液
2、HAT選擇性培養基 50X
3、HT選擇性培養基 50X
4、胎牛血清
5、Hybridoma Feeder添加因子
2.2 方法
2.2.1 骨髓瘤細胞SP2/0的準備
骨髓瘤細胞SP2/0細胞應大小均一透亮，形態渾圓，聚集呈葡串狀。用含10%胎牛血清的1640培養基培養至對數生長期時才可以用于細胞融合。
細胞融合前1～2天，根據細胞生長狀況和密度進行擴大培養（一般融合一只免疫鼠的脾臟細胞需要3～4個10mm培養皿的SP2/0細胞，細胞密度~80%）。
備注：
1、SP2/0細胞為懸浮細胞，生長速度較快，應及時換液和傳代；
2、SP2/0狀態的好壞將直接影響后續細胞融合實驗的結果，所以調整好細胞狀態是極其關鍵的一步。
2.2.2 融合準備
在一些細胞培養實驗中，單個或少數分散的細胞不易生長繁殖，若加入其它活細胞，則可促進這些細胞的生長繁殖，所加入的這種細胞數被稱為飼養細胞。常用的飼養細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞、小鼠脾臟細胞或胸腺細胞，也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經放射線照射后作為飼養細胞。此外，也可以選擇添加特殊的細胞培養因子試劑完全代替飼養層細胞的使用，實現標準化實驗操作。
在單抗制備實驗中，融合時會選擇小鼠腹腔巨噬細胞做飼養層，克隆化時則選擇脾臟細胞做飼養細胞。
備注：
1、飼養細胞的量為一般為2×10^4或10^5 cell/well；
2、本文將闡述制備飼養層細胞和添加細胞培養因子試劑兩種實驗方法。
2.2.2.1 方法一：融合用飼養層細胞制備
腹腔巨噬細胞來源方便并且制備簡單，最重要的是其中的巨噬細胞具有清除死亡細胞和吞噬細胞碎片的能力，因此一般融合時會選擇腹腔巨噬細胞作為飼養層細胞。腹腔巨噬細胞于融合前1天進行準備。一只鼠的腹腔巨噬細胞可以制備2塊96孔的飼養層細胞板，一只免疫鼠的脾臟可用于融合4塊96孔板。
1、取7～8周齡Balb/c雌鼠脫頸椎處死，于75%酒精浸泡消毒5min；
2、超凈工作臺內用無菌手術剪將小鼠腹部剪開一個小口，鑷子剝離周圍皮膚以便露出腹腔；
3、手術剪將腹腔剪開一個小口，用一次性無菌膠頭滴管將預冷的不完全培養基注入腹腔內，沿著腹腔壁多次吹洗，將腹腔內的細胞充分懸起后轉移至新的50ml離心管，重復3~4次；
4、1000~1200rpm，~5min離心，棄上清，加入適量預冷的不完全培養基重懸細胞，1000~1200rpm，~5min離心，洗滌細胞2~3次；
5、棄上清，加入1ml完全1640培養基重懸細胞，然后稀釋至所需用量體積，100μl/well加入96孔板；
6、37℃，5%CO2飽和濕度細胞培養箱培養，備用。
2.2.2.2 方法二：添加細胞培養因子
1、融合和亞克隆階段：10%（v/v）Hybridoma Feeder添加因子加入到完全培養基中；
2、細胞擴大培養和復蘇階段：2.5%-5%（v/v）Hybridoma Feeder添加因子加入到完全培養基中
備注：
添加因子只作為細胞培養添加劑使用，不可代替血清。
2.2.3 免疫鼠脾細胞的準備
細胞融合當天取三天前沖擊免疫過的小鼠作為免疫脾細胞的來源，一般情況下免疫小鼠的脾臟體積大小是正常小鼠的兩倍。
1、免疫小鼠脫頸椎處死，于75%酒精浸泡消毒5min；
2、在超凈工作臺內用高壓滅菌好的手術剪將小鼠胸腔左下側開一個小口；
3、用鑷子摘取脾臟后放于含3~5ml不完全培養基的皿中，剔除周圍結締組織；
4、將脾臟轉移至潤濕的0.4目篩網中用研磨棒輕柔研磨，加入適量預冷的不完全培養基制成細胞懸液，1000~1200rpm，~5min離心；
5、棄上清，適量不完全培養基重懸細胞，1000~1200rpm，~5min離心，洗滌細胞2~3次；
6、適量不完全培養基重懸細胞，計數后備用。
備注：
研磨脾臟時需要保證篩網濕潤且研磨力度不能過大，全程注意無菌操作。
2.2.4 融合
準備~25ml不完全培養基作為融合終止液與配置好的PEG溶液提前放于37℃細胞培養箱進行預熱。融合前用槍將SP2/0細胞從培養皿底吹下懸起，收集于50ml離心管內，1000~1200rpm，~5min離心，洗滌細胞2~3次，再加入10ml不完全培養基重懸細胞，計數后備用。
1、分別將1×10^8小鼠脾細胞和2×10^7骨髓瘤細胞重懸于25ml無血清培養基中（用50mL一次性離心管）；
備注：
融合時將骨髓瘤細胞SP2/0和免疫鼠脾細胞比例調至1:5~1:10的融合效果最好
2、200~400g，離心5~10 min，棄去上清；
備注：
盡量去除干凈，避免稀釋PEG影響融合效果
3、輕拍管底，充分打散沉淀，將1ml經過37℃預熱的50% PEG 1450勻速加入離心管中（用1ml的移液器，1 min內加完），期間用移液器槍頭輕柔攪拌；
4、持續緩慢的用槍頭攪拌1~2分鐘；
5、勻速加入1ml經過37℃預熱的不完全培養基（1 min內加完），期間用移液器槍頭輕柔攪拌；
6、再勻速加入3ml經過37℃預熱的培養基（3 min內加完），期間用移液器槍頭輕柔攪拌；
7、再加入10ml經過37℃預熱的培養基。37℃孵育5 min，200~400g離心~5分鐘取細胞；
8、棄上清，加入10ml完全培養基輕輕懸起融合的細胞后再稀釋至所需用量（融合4塊96孔板，需加至42ml）；
9、將融合好的細胞加入到完全培養基中種入昨日提前準備好的96孔細胞板中，100μl/well，37℃，5%CO2飽和濕度細胞培養箱培養；
10、融合后24小時內補加含HAT的選擇性補液培養基，50μl/well；
11、補液兩天后進行第一次半換液，每孔吸出50～80μl的培養基，第一次半換液培養基內HAT含量減半，50μl/well；
12、再過兩天后進行第二次半換液，每孔吸出50～80μl培養基，換成含HT的培養基，50μl/well。
備注：
左圖為融合后圖片，大而圓形透亮的細胞為融合成功細胞；右圖為篩選培養后的圖片，圓形透亮的為篩選培養成功的雜交瘤細胞。
三、雜交瘤細胞克隆化?
雜交瘤細胞的克隆化一般是指針對于抗體陽性孔的克隆化。在實際實驗操作中，會有數個或者更多的克隆，其中可能包括所需的抗體分泌細胞，抗體非分泌細胞，及其他無關抗體的分泌細胞。克隆化的原則是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進行克隆化。因為非抗體分泌細胞的生長速度比抗體分泌細胞的生長速度快，抗體分泌細胞的生長就會被抑制，最終二者的競爭結果會造成抗體分泌細胞的丟失。
一般通過使用有限梯度稀釋法對雜交瘤細胞進行多次克隆化篩選，在細胞群體中選育出遺傳穩定的同源細胞系。該細胞系是可以穩定分泌單一抗體的雜交瘤細胞。
3.1 實驗用材料
主要試劑：
1、胎牛血清
2、HT選擇性培養基 50X
3.2 方法
有限稀釋法克隆化
第一次克隆化時，融合后的雜交瘤細胞狀態還很脆弱，所以我們使用含HT和20%胎牛血清的完全1640完全培養基進行克隆化。后續可以使用正常的含10~20%血清的完全培養基進行克隆化?？寺』瘯r選擇脾臟細胞做飼養細胞，具體實驗操作步驟如上。
1、把挑選出來的陽性孔內的細胞完全吹懸后鏡下細胞計數，在5ml青霉素小瓶或離心管內用完全1640培養基進行梯度稀釋；
2、每一濃度梯度的細胞懸液加入96孔脾細胞飼養層板中，100μl/well，同一濃度梯度種2～3列細胞孔，一般一個陽性孔我們會選擇有限梯度稀釋后克隆化半塊或者一塊96孔板，相應的稀釋3～4個濃度梯度；
3、37℃，5%CO2飽和濕度細胞培養箱培養，第5～6天后鏡下觀察細胞生長狀態，適當補加培養基，同時可用記號筆在板底圈出單/少個雜交瘤細胞團生長的細胞孔，方便后續檢測使用；
4、當標記孔內的雜交瘤細胞布滿1/10底面積時，可用間接ELISA法檢測細胞上清中的抗體含量。
備注：
1、圖為單個雜交瘤細胞團；
2、每次克隆化檢測后，優先挑選細胞上清中抗體效價高，孔內單/少個克隆細胞生長，形態良好的細胞孔以進行下一次的克隆化。并根據細胞生長狀況盡快進行下一次克隆化；
3、第一次克隆化時為了確保雜交瘤細胞能夠穩定生長，可在克隆化時將每孔內的細胞密度稀釋至5、2、1個細胞。后續克隆化時為了保證可以逐漸形成單克隆細胞株，可將每孔內的細胞密度調至2、1、0.5個細胞。
四、抗體亞型鑒定及腹水制備?
不同亞型的抗體在結構上有所區別，其免疫源性與在體內發揮的作用存在差異，在生物體內具有不同的功能效應，因此在篩選雜交瘤時需要確定高表達量的陽性克隆是否是所需要的亞型分子；而且，明確抗體的亞型有助于選擇更加適合的抗體純化方法，從而獲得更高的抗體獲得率；對抗體進行進一步的細分，并進行抗體亞型鑒定，對于疾病作用機理的研究和抗體藥物的開發，均有重要意義。
大量生產單克隆抗體的方法主要有三種：（1） 大量培養雜交瘤細胞，從細胞培養上清液中獲取的抗體含量為10～60μg/ml；（2） 將對數生長期的雜交瘤細胞按1～3×10^7/ml接種于小鼠皮下，每處注射0.2ml，每只注射2～4個點，待10～20天左右即可進行采血，抗體的含量可達1～10mg/ml；（3）小鼠腹腔注射適量佐劑后，將雜交瘤細胞按照1～2×10^6cell/只的量打進腹腔。在小鼠瀕死時收集腹水，一般一只小鼠可獲得5～10ml腹水，抗體含量可達5～10mg/ml。
4.1 實驗用材料
4.1.1 實驗動物
腹水制備時通常選用10~11周齡的Balb/c雌鼠，所有實驗動物均皮毛光亮，精神狀態良好。維持21～27℃的飼養溫度且每日提供光照/黑暗環境12/12h循環。
4.1.2 主要試劑
1、小鼠單抗Ig類/亞類鑒定用ELISA試劑盒(IgG1\IgG2a\IgG2b\IgG3\ IgM\IgA\Kappa\Lambda)
2、腹水專用佐劑
4.2 方法
4.2.1 抗體亞型鑒定
抗體是在機體內產生的“Y”構型的免疫球蛋白，基于小分子多肽結構上的差異，可細分為重鏈和輕鏈。重鏈可分為IgG、IgA、IgM、IgD和IgE5類，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。不同類的Ig具有不同的特征，即使是同一類的Ig，因其鉸鏈區氨基酸組成和重鏈二硫鍵的數量、位置不同，又可將同類Ig分為不同的亞類。輕鏈可分為κ鏈和λ鏈兩類，根據λ鏈恒定區個別氨基酸的差異，又可將λ鏈分為λl、λ2、λ3和λ4四個亞型。
常規小鼠單抗Ig類/亞類鑒定用ELISA試劑盒利用雙抗體夾心法鑒定小鼠淋巴細胞雜交瘤培養上清中單克隆抗體或特異親和純化的單克隆抗體的類和亞類。
4.2.2 腹水制備
1、將佐劑注射Balb/c小鼠腹腔，每只0.3~0.5ml處理腹腔7~15天左右，將篩選出來的雜交瘤細胞株擴大培養后接種到Balb/c小鼠腹腔內；
2、注射雜交瘤細胞7天左右小鼠腹部會開始腫脹，此時每日都應進行觀察，以防小鼠突然死亡，當小鼠出現進食困難，行走不便，毛色暗沉時將小鼠處死，進行一次性腹水的提??；
3、小鼠脫頸椎處死，于75%酒精浸泡消毒5min；
4、用手術剪將小鼠腹部剪開一個小口，剝離周圍皮膚露出腹腔，隨后將腹腔剪開一個小口，將膠頭滴管伸入腹腔內將積液吸取至干凈的15ml離心管內；
5、3000rpm，10min離心，無色透明的中間層即為腹水。
備注：
離心后可以將腹水轉移至新的離心管內-20℃凍存（上層為礦物油層，下層為細胞層），也可與滅菌甘油等比混勻后放于-20℃冰箱長期保存。
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