實驗之前老板都會說，要是沒有想好就先點個CCK8吧，于是CCK8成了實驗的首選；

先說明一下CCK8的來歷：

CCK-8實驗，全稱為Cell Counting Kit-8實驗，是一種廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性檢測的實驗方法。該實驗方法起源于對細胞增殖和毒性分析的需求，旨在提供一種簡便、準確且靈敏度高的檢測手段。

CCK-8實驗的主要原理基于其試劑盒中的核心成分——WST-8（化學名為2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）。關于WST-8在CCK-8試劑中的濃度，這通常是由試劑制造商根據實驗需求和優化結果來確定的，不同的商業CCK-8試劑盒中WST-8的濃度可能有所不同。

在活細胞中，WST-8能夠被線粒體內的脫氫酶還原為水溶性的橙黃色甲瓚產物（Formazan）。這種產物的生成量與活細胞的數量成正比，因此，通過測量反應后溶液的顏色深淺，可以間接反映活細胞的數量和增殖情況。

CCK-8實驗具有多種優點，如操作簡便、省時省力、靈敏度高、線性范圍寬、數據可靠且重現性好等。此外，CCK-8實驗對細胞的毒性較小，無需使用放射性同位素和有機溶劑，因此更加安全環保。這使得CCK-8實驗在細胞生物學、藥理學、腫瘤學等多個領域得到了廣泛應用，如細胞增殖速率比較、材料毒性評價、新藥篩選、腫瘤藥敏試驗等。

CCK-8怎么做？具體的操作步驟來啦：

一、細胞數量測定

1.將細胞懸浮液（100μL/孔）接種在96孔板中。在加濕的培養箱中預培養平板（例如，在37°C、5%CO2下）。

2.向板的每個孔中加入10μL CCK8溶液。小心不要將氣泡引入井中，因為它們會干擾外徑讀數。

3.將培養板在培養箱中孵育1-4小時。

4.使用酶標儀測量450nm處的吸光度。

二、細胞增殖和細胞毒性試驗

1.在100μL待測培養基中以10^3-10^4個細胞/孔的密度在96孔板中接種種子細胞，將細胞在37°C的CO2培養箱中培養24小時。

2.將不同濃度的待測物質加入板中。

3.將培養板在培養箱中培養適當的時間（例如6、12、24或48小時）。

4.使用重復移液器向板的每個孔中加入10μL CCK8溶液。小心不要將氣泡引入井中，因為它們會干擾外徑讀數。

5.將培養板在培養箱中孵育1-4小時。

6.在讀取印版之前，重要的是在軌道振蕩器上輕輕混合1分鐘，以確保顏色均勻分布。

7.使用酶標儀測量450nm處的吸光度。

三、數據分析

有幾種方法可以進行統計分析。您可以選擇使用O.D.值或單元格編號，如下是我常用的一個計算方式：

細胞存活率（%）=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100

抑制率（%）=[（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100

As=實驗孔的吸光度（細胞、培養基、CCK8和測試化合物孔的吸光度）。

Ab=空白孔吸光度（含有培養基和CCK8的孔的吸光度）。

Ac=對照孔吸光度（含有細胞、培養基和CCK8的孔的吸光度）。

四、繪制標準曲線

1.細胞計數板對細胞懸浮液中的細胞數量進行計數。

2.使用培養基，將細胞懸浮液稀釋至濃度梯度，通常需要5-7個濃度梯度，每組幾個重復孔。我一般重復3個，然后接種細胞。（注意每個孔的細胞數量。如果你在離心管中稀釋細胞懸浮液，在加入孔板之前，需再次混勻。每個孔中細胞懸浮液的體積應該相同。）

3.孵育至細胞貼壁（通常2-4小時），然后每100μl培養基加入10μl CCK8。繼續孵育1-4小時，用酶標儀測量450nm處的吸光度。以單元格數量為X軸坐標，外徑值為Y軸坐標，繪制一條標準曲線。

小提醒一下：待測試樣品的細胞數量可以根據曲線確定。使用此標準曲線的先決條件是培養條件相同。

                       T24穩轉株CCK-8檢測，檢測濃度單位為ug/ml

CCK-8實驗的坑要避一下，雖然條條大路通羅馬，我們不能在去往羅馬的路上掉坑里摔自己

1.確保藥物和CCK8在培養基中均勻分布。

2.細胞增殖越多，顏色越深；細胞毒性越強，顏色越淺。

3.對于貼壁細胞，每孔至少1000個細胞（100μl培養基）。對于白細胞，由于其低靈敏度，每孔（100μl培養基）至少需要2500個細胞。推薦的96孔板每孔的最大細胞數為25000。如果使用24孔或6孔板進行測試，則計算每孔的相應細胞數量，并將CCK8的體積調整為每孔總液體體積的10%。

4.由于CCK8測定基于活細胞中的脫氫酶活性，因此影響脫氫酶活性的條件或化學物質可能會導致活細胞的實際數量與使用CCK8測量的活細胞數量之間的差異。

5.WST-8可以與還原劑反應形成WST-8甲氮。如果使用還原劑（如一些抗氧化劑），它會干擾測試。如果待測系統中存在更多的還原劑，則有必要將其清除。

6.孵育2小時后，背景O.D.值通常為0.1-0.2單位。

7.注意不要將氣泡引入孔中，因為它們會干擾外徑值。

8.如果要對CCK8溶液進行消毒，請使用0.2μm的膜過濾溶液。

9.孵育時間將根據孔中細胞的類型和數量而變化。一般來說，白細胞顏色較淺，可能需要更長的孵育時間（長達4小時）或大量的細胞（約105個細胞/孔）。

10.如果細胞懸浮液中有高濁度，測量并減去樣品在600 nm或更高波長下的O.D值。

11.CCK8不能用于細胞染色。

12.培養基中的酚紅不影響實驗結果。計算時，可以通過減去空白孔中背景的吸光度來消除酚紅的吸光度，因此不會影響檢測。

13.CCK8的毒性很低。CCK8測定完成后，相同的細胞可用于其他細胞增殖測定，如結晶紫測定、中性紅測定或DNA熒光測定。（除非細胞極為罕見，否則不建議使用。）

14.CCK-8試劑盒可用于大腸桿菌，但不能用于酵母菌等真菌的檢測。

15.在檢測孔板之前，你可以在搖床上輕輕搖一下30S也足夠。

16.我們建議在平板中心附近的孔中接種細胞。最外圈孔中的介質很容易蒸發，可以用PBS、水或介質填充。

17.如果你沒有450nm濾光片。您還可以使用吸光度在430至490 nm之間的濾光片，以及450 nm濾光片以獲得最佳靈敏度。

18.測量450nm處的吸光度。如果需要進行雙波長測量，可以將650nm處的吸光度確定為參考波長。

19.藥物中金屬離子的存在可能會影響CCK8的敏感性。終濃度為1mM的氯化鉛、氯化鐵和硫酸銅抑制了5%、15%和90%的顯色反應，降低了靈敏度。如果最終濃度為10mM，它將被100%抑制.

實驗證明CCK-8的靈敏度比MTS、MTT靈敏度都要高：

實驗證明只有CCK-8才能讓細胞存活更長：

附帶WST-8吸光光譜：

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