光的吸收導(dǎo)致染料分子進(jìn)入電子激發(fā)態(tài)。吸收的能量?jī)H儲(chǔ)存很短的時(shí)間，并且可以在激發(fā)態(tài)壽命結(jié)束后再次輻射，例如作為熒光。
在染料溶液中，被激發(fā)的染料分子可以被視為電偶極子或振蕩器，如果它們之間的距離足夠大，則它們不會(huì)相互影響。
當(dāng)發(fā)色團(tuán)之間的平均距離約為5-10nm時(shí)，振蕩器的“輻射場(chǎng)”才產(chǎn)生影響。兩種染料分子之間的這種相互作用可以通過(guò)福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）模型來(lái)描述。
如果發(fā)色團(tuán)之間的距離變得更小，例如在非常濃縮的溶液中，則各個(gè)振蕩器可以通過(guò)靜電相互作用強(qiáng)烈地相互影響。由于單個(gè)染料分子的分子間相互作用，這種燃料溶液的吸收和熒光行為都會(huì)發(fā)生強(qiáng)烈變化。
水中的羅丹明6G
濃縮的羅丹明6G水溶液的UV/Vis光譜顯示主吸收帶的短波側(cè)翼有一個(gè)肩部。通過(guò)稀釋溶液并增加比色皿的光程（d）來(lái)改變濃度（c）以彌補(bǔ)稀釋?zhuān)锤鶕?jù)朗伯-比爾定律總是期望相同的吸光度，可以觀察到以下光譜：
等吸光點(diǎn)的出現(xiàn) - 所有相關(guān)物質(zhì)的濃度變化是線(xiàn)性的，dE/dc = 0，表明兩種（或更多）物質(zhì)彼此處于動(dòng)態(tài)平衡。
解離或締合/絡(luò)合常數(shù)可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定：在稀釋系列中，溶液的稀釋始終通過(guò)光程的變化進(jìn)行補(bǔ)償，“有效消光系數(shù)”可以通過(guò)在（單體）最大，了解稀釋因子和初始樣品濃度。該樣品濃度是根據(jù)不發(fā)生二聚化的非常稀釋的溶液的紫外光譜確定的。由于朗伯-比爾定律中不同物種的吸收表現(xiàn)相加，因此可以通過(guò)了解基礎(chǔ)反應(yīng)來(lái)寫(xiě)出有效消光或有效消光系數(shù)。通過(guò)解離常數(shù)的參數(shù)變化和圖形分析，獲得一條直線(xiàn)，從其斜率和軸截面可以確定單體和二聚體的消光系數(shù)。
疏水相互作用
有機(jī)染料的聚集尤其發(fā)生在水或高離子強(qiáng)度的溶劑中。主要原因是分子間范德華力，即所謂的“疏水相互作用”。親脂性染料分子通過(guò)使水合物殼具有盡可能小的表面積來(lái)試圖避開(kāi)親水性水分子。這種現(xiàn)象也是導(dǎo)致染料吸附在玻璃表面或與基材分子非特異性結(jié)合的原因。
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形成二聚體或更高聚集體的趨勢(shì)取決于
?-染料的濃度- 濃度越高，聚集越大
-溶劑- 在水或甲醇中，與乙醇或其他有機(jī)溶劑不同，可以更頻繁地觀察到聚集。通過(guò)比較ATTO 565在PBS緩沖液（pH 7.4）和乙醇與三氟乙酸 (TFAc) 中的等濃度溶液的吸收光譜，令人印象深刻地證明了這一點(diǎn)：
-存在的任何電解質(zhì)（鹽），尤其是在氯仿等有機(jī)溶劑中形成離子對(duì)（染料陽(yáng)離子和抗衡離子）時(shí)
-溫度- 在較高溫度下，熱運(yùn)動(dòng)使聚集更加困難
-染料的分子結(jié)構(gòu)- 染料與疏水性更強(qiáng)的染料（例如ATTO Rho6G、ATTO Rho11、ATTO Rho12等）相比，親水基團(tuán)（例如ATTO 488?、?ATTO 532?、ATTO?542等）在水溶液中不會(huì)發(fā)生聚集：
由于這是動(dòng)態(tài)平衡，因此可以通過(guò)稀釋溶液將二聚體重新轉(zhuǎn)化為單體。當(dāng)測(cè)量的吸收光譜不隨著進(jìn)一步稀釋和光路的相應(yīng)增加而改變時(shí)，就達(dá)到了“單體光譜”。對(duì)于大多數(shù)疏水性ATTO染料，吸光度約為0.04。
蛋白質(zhì)綴合物中的分子內(nèi)相互作用/DOL測(cè)定
染料NHS酯與蛋白質(zhì)氨基的反應(yīng)可能會(huì)產(chǎn)生染料綴合物，其中共價(jià)結(jié)合的染料分子緊密相鄰并且可以彼此相互作用。這可能會(huì)導(dǎo)致吸收光譜發(fā)生強(qiáng)烈變化，如ATTO 565階梯親和素綴合物的示例所示：
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在綴合物光譜中，觀察到附加的短波吸收帶，類(lèi)似于濃度足夠高的染料水溶液。由于這是共價(jià)結(jié)合的染料分子的分子內(nèi)相互作用，因此當(dāng)綴合物溶液稀釋時(shí)，吸收光譜不會(huì)改變！
聚集體有兩種主要類(lèi)型：
H聚集體（H = hypsochrome）
當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)染料分子以其躍遷偶極矩定位時(shí)（通常沿著S0?-S1中發(fā)色系統(tǒng)的縱軸），就會(huì)發(fā)生這種類(lèi)型的聚集。過(guò)渡）彼此平行。與單體吸收相反，觀察到吸色偏移的吸收帶。?由于空間接近，電子軌道相互影響，兩個(gè)分子必須被視為一個(gè)整體。能級(jí)被分開(kāi)，量子力學(xué)規(guī)則允許的吸收具有更高的能量，因此發(fā)生在更短的波長(zhǎng)處。從這種能量較高的激發(fā)態(tài)開(kāi)始，會(huì)發(fā)生快速的內(nèi)部轉(zhuǎn)換（IC），因此不再可能產(chǎn)生熒光。
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J聚集體（根據(jù)EE Jelley）
?這種類(lèi)型的聚集會(huì)導(dǎo)致吸收帶的長(zhǎng)波偏移，這與能帶半寬度的顯著減小有關(guān)。
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?J聚集體通常存在于聚次甲基染料中，例如花青、部花青或類(lèi)似的發(fā)色團(tuán)。Jelley和Scheibe首次在假異花青染料上獨(dú)立觀察到了這一現(xiàn)象。
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對(duì)于由單個(gè)染料組合而成的 "超分子聚合物"，人們提出了不同類(lèi)型的模型描述。對(duì)分子關(guān)系最簡(jiǎn)單的描述是，單個(gè)分子一前一后排列，因此過(guò)渡偶極矩也是一致的。分子的集體考慮導(dǎo)致能級(jí)分裂： 量子力學(xué)允許的轉(zhuǎn)變現(xiàn)在能量較低，這就解釋了吸收帶的長(zhǎng)波偏移。
聚集會(huì)受到溶劑組成、鹽或添加劑的添加以及染料濃度的強(qiáng)烈影響。在理想條件下，可以在紫外/可見(jiàn)光譜中觀察到極窄的吸收帶。與H聚集體相反，這種類(lèi)型的聚集體可以發(fā)出熒光，尤其是在較低溫度下：然而，非常窄的發(fā)射帶的最大值相對(duì)于吸收最大值僅紅移幾納米。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，文獻(xiàn)中報(bào)道了吸收帶的“加寬”，這可以通過(guò)包含J聚集體的禁電子轉(zhuǎn)移來(lái)解釋。
ATTO 488標(biāo)記磷脂
ATTO 488標(biāo)記的磷脂在氯仿中的溶液首先會(huì)呈現(xiàn)出意想不到的顏色： 未稀釋的該溶液不是淺黃色和明亮的綠色熒光，而是呈現(xiàn)粉紅色至洋紅色。這種長(zhǎng)波偏移吸收可以用J聚合物的存在來(lái)解釋。當(dāng)用甲醇稀釋該溶液時(shí)，顏色會(huì)變?yōu)辄S色，并發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。通過(guò)改變?nèi)軇┏煞?，聚集體就會(huì)減少。下圖顯示了ATTO 488標(biāo)記的1,2-雙(二苯基膦)乙烷（DPPE）在純氯仿和在氯仿/甲醇（8:2，V/V）混合溶劑中的兩種溶液的情況：
左邊顯示的是兩種溶液在正常日光下的情況。右圖中，與甲醇混合的溶液在紫外線(xiàn)（366納米）照射下發(fā)出的綠色熒光特別明顯。
參考文獻(xiàn)
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