c .上樣染料和緩沖液選擇
制備凝膠電泳時，樣品中添加了凝膠上樣緩沖液 (通常是6X或10X的原液)。 上樣緩沖液包括如下組分:
密度成分，如甘油或蔗糖，增加樣品粘度，確保樣品沉入孔中。
鹽，如Tris-HCl，為樣品創造良好的離子強度和pH值環境。 高鹽濃度的上樣緩沖液會產生更大片或扭曲的條帶以及污點。
金屬螯合劑，如EDTA，可阻止樣品中的核酸酶降解核酸。
染料 為監測樣品的上樣、電泳進展和pH值變化提供了顏色指示。 部分上樣緩沖液可能包含多個染料，以便有效跟蹤樣品中不同大小分子的遷移。
通常，上樣染料都是帶負電荷的小分子，因此遷移方向與核酸相同。 其中有的顯示pH值顏色，上樣和運行時可作為樣品的pH指示劑(圖9A)。 常用染料包括溴酚藍、二甲苯青,苯酚紅,和橙色G。選擇上樣緩沖液時,需注意染料的表面遷移(s)(圖9B, 表5和6)以避免遮蓋目的核酸條帶,特別是分子大小接近時(圖9C)。 染料遮蓋會影響目的條帶的分析和量化，導致結果不可靠。
圖9.(A)中性pH中染料顏色。(B)在TAE和TBE緩沖液中不同百分比瓊脂糖里的染料遷移。(C)在可視化過程中染料陰影遮蓋條帶。
有時,上樣緩沖液包含清洗劑或還原劑，如SDS, 尿素和甲酰胺，以用于變性。此類添加劑可破壞核酸分子內部和分子間的相互作用，促成線性或單鏈的分子構象。為獲得最佳分離結果，應將樣品和變性劑加入至上樣染料中一同加熱（圖 10A）。對來源于酶反應的雙鏈DNA電泳，可將SDS添加到上樣緩沖液，以破壞蛋白質和核酸之間的相互作用，防止樣品遷移性改變（圖10B）。
圖10,熱量、SDS對樣品電泳的影響。(A) 在不加熱處理的情況下，將含有RNA分子量標準的變性緩沖液加入凝膠中。 (B) 在有或無SDS的上樣緩沖液中準備來源于限制性內切和連接反應的DNA樣品。 在凝膠上樣前，加熱SDS中的樣品。
3.運行電泳
在凝膠、標準品和樣品制備后，進行電泳。拆卸梳子和添加電泳緩沖液前，凝膠須完全凝固。凝膠梳應平穩地向上提起，以免撕裂凝膠、扭曲膠孔。移除梳子和添加緩沖液后，注意清除孔里的氣泡。對于聚丙烯酰胺凝膠，應用緩沖液徹底沖洗膠孔，以清除殘留未聚合的丙烯酰胺。
水平凝膠應朝向凝膠盒，樣品孔位于負極一側，以便在電泳啟動后，將樣品移動至正電極側（圖11A）。該方向可記為“跑向紅色”，因為正電極通常為紅色。 垂直凝膠盒中，膠孔設計在頂部（圖11B）。
圖11.水平和垂直電泳系統的凝膠裝置。 箭頭表示電泳中核酸遷移的方向。
a.電泳緩沖液選擇
電泳緩沖液為具有緩沖能力的離子溶液，通常在凝膠中使用，以保證電流流動同時防止pH值變化。電泳過程中，由于電子流動，負極逐漸偏向堿性，正極逐漸偏向酸性，從而導致水電解和pH值改變（表6）。氫氣和氧氣的釋放會引起電極起泡，這是凝膠運行的跡象。理想情況下，電泳緩沖液和凝膠制備緩沖液應相同，以確保有效的導電性。
表6.兩個電極的化學反應和pH值變化。
電泳緩沖液的選擇取決于樣品大小、運行時間和后電泳過程，其中Tris-醋酸鹽EDTA（TAE）和Tris-硼酸 EDTA（TBE）是最常用的兩種緩沖液（表 7）[2,7]。
因為不容易形成污點，TAE適用于>1500bp的片段。由于緩沖能力較低，TAE更適合短時間的電泳運行(例如<2小時)。TAE緩沖能力較低，長時間運行凝膠會導致過熱，樣品變性和/或擴散以及凝膠融化（可能）。
TBE緩沖能力較高，不易導致過熱，因此更適合長時間運行。對于較短片段的分離，TBE效果更佳，而在TBE中，dsDNA遷移得更慢。TBE可抑制酶，因此不適合涉及酶學步驟的下游應用，如限制內切、克隆和PCR。
使用離子強度高于1X TAE或0.5-1X TBE緩沖液，可更快地移動樣品，但由于高導電性會產生大量的熱量，容易導致樣品變性和凝膠損傷。
凝膠應完全浸在緩沖液中，以確保離子流動，防止凝膠干（圖12A）。然而，當使用水平凝膠時（例如，瓊脂糖），凝膠上的緩沖液深度應低于3–5mm。緩沖液過高（>5 mm）會導致核酸遷移性降低，加大條帶扭曲和過熱。
圖12.電泳緩沖液對電泳的影響。(A) 在電泳過程中，凝膠的頂部部分未被浸沒。(B) 在低于推薦濃度的鹽濃度緩沖液中運行凝膠（與凝膠制備中使用的緩沖液不同）。
注意，變性瓊脂糖的電泳緩沖液可能既不是TAE，也不是TBE，因為這些凝膠可能在不同的緩沖液中制備，如磷酸鈉和MOPS。選擇與所用凝膠兼容的電泳緩沖液非常重要（圖12B）。
b.電壓
采用恒定電壓、電流或功率通過凝膠，施加電勢，開始運行凝膠。核酸電泳中常用恒壓，一般為5–10 V/cm。
施加的電壓(V)=電極間的距離(cm)x建議V/cm
可根據需要分離的DN**段的大小調整電壓，也可以根據所使用的電泳緩沖液的類型進行調整（表 8）。市售核酸分子量標準通常提供建議電壓，以便每個產品片段實現最佳分離。注意，電壓極低會減緩核酸的遷移，從而導致小分子的擴散和分辨率過低（圖13A）。另一方面，電壓過高，會導致較差的分離效果和樣品污點；有時，還會造成緩沖液過熱，“微笑型條帶”，甚至是樣品變性（圖13B）。
圖13. 電壓對DNA電泳的影響。 (A)低電壓導致條帶分辨率差和擴散。 (B)高電壓導致“微笑型條帶”。
某些情況下，可將溫度探頭連接至凝膠裝置，以幫助控制緩沖液的冷卻和加熱。 電泳運行>2小時，緩沖液的冷卻和再循環可改善樣品分離。變性凝膠允許緩沖液加熱至55°C，從而改善核酸單鏈形式，提升實驗結果。
c.運行時間
凝膠長度、所用電壓和樣品中的分子大小決定電泳所需的時間。通常，電泳會持續到目的條帶遷移至凝膠長度的40-60%。凝膠運行的特定時間，可觀察到上樣染料的相對位置，直至溴酚藍染料已遷移約60%的凝膠長度和/或橙G染料已遷移80%的凝膠長度。此外，應監測運行時間，以確保樣品或標準品中最小的分子不移出凝膠。注意，運行時間過短則不能完全分辨條帶（圖14）。含有示蹤染料的DNA分子量標準可協助監測凝膠的運行，同時也可確保條帶不被染料所遮蓋。
圖14.運行時間對樣品分離的影響。
4.在凝膠中可視化樣品
凝膠運行完成后，需對樣品進行可視化分析。由于普通照明環境下，核酸不可見，因此需要一種可視化的檢測方法。如表9所述，可用方法在樣品檢測中，提供了不同的靈敏度和增益范圍[6]。
a.熒光染色
現有的染色劑中，因熒光染料易于使用，靈敏度高，所以在樣品檢測中應用最為廣泛(圖15)。 當用適當波長激發時，染料發出可見光(即，熒光)。熒光強度與其和核酸結合的數量有關—這是檢測和定量測定電泳中核酸的基礎。
圖15.不同類型的核酸結合染料。
溴化乙錠(EtBr) 染色時間短（約30分鐘），靈敏度高（可檢測到1 ng雙鏈DNA/條帶），為核酸電泳中的常用熒光染料。還可考慮另一種染料，原因如下:
誘變和處置: 溴化乙錠是高度誘變劑，所以熒光染料的 危險性較小，無需特殊處理，在核酸電泳中可提供安全工作流程(圖16)。
靈敏度：靈敏度高于EtBr的熒光染料，適合檢測少量樣品(圖16)。 因為有較少的堿基堆積，單鏈核酸的可視化通常需要更多樣品和/或嵌入染料。 因此， 優先結合單鏈核酸的染料是RNA電泳樣品檢測的最佳選擇。
紫外線損害：可用低能量藍光（而非紫外光）來激發的熒光染料對核酸結構損傷較小，其靈敏度（圖17A）不僅相同，甚至更高。 因此，電泳中使用藍光激發可提高下游的成功應用，如克隆和測序（圖17B）。
圖16.特性增強的溴化乙錠替代品
圖17.(A)常見核酸染色的激發和發射光譜。最有效的波長被稱為激發極大值。SYBR安全與SYBR金染料通過藍光和較低的紫外光可最大程度激發。(B)用藍光(針對SYBR安全染料)或紫外光(溴化乙錠)后的克隆效率，用于在電泳過程中顯示克隆插入。用x-Gal培養皿上形成的藍色菌落數量來衡量膠-純化lacZ片段的克隆效率，其表明已將功能(未突變的)基因插入到載體中。
b.紫外陰影
在染料染色處，可通過稱作紫外陰影的方法間接觀察核酸，利用核酸[8]來吸收紫外線。該方法通常用于通過電泳分離和純化寡核苷酸和RNA，這種情況下，簡單檢測已足夠，和/或使用嵌入染料會影響下游的應用。為通過紫外陰影進行檢測，需要納克到微克的樣品，并使用薄而透明的凝膠（如聚丙烯酰胺）以確保紫外線的吸收和透射。紫外陰影方法中，電泳后將凝膠從盒中取出（以便最大程度檢測），用透明的塑料薄膜包裹后放置在UV-熒光薄層色譜板上。當凝膠至于紫外線輻射下時，核酸條帶的吸收會在TLC板上投射陰影（圖18）。將所需大小凝膠的陰影部分剪去，以作進一步處理。
圖18.紫外陰影使分離的片段顯象。
5.記錄凝膠
a.熒光成像技術
可視化后，核酸凝膠通常被存檔記錄下來，用于記錄和分析電泳結果。如果樣品被熒光染料染色，需特殊設備以適當的光源激發染料，使其顯象并捕捉凝膠圖像。激發光源在凝膠上，稱為反射照明器（類似于手持式紫外線燈），或在凝膠下，稱為透照器 (圖19)。由于反射照明器上的光源位置較遠，所以樣品收到的能量較少。這樣可以減少紫外線對核酸的損害，但也會降低凝膠條帶的信號。另一方面，透照器可為條帶提供更高的信號，但由于輻射接近凝膠，會增加紫外線造成的傷害。
圖19.反射照明器和透照器。
b.放射自顯影法
在放射性核酸的電泳過程中，凝膠電泳后會暴露在x射線膠片上，這一過程即稱為 放射自顯影法。條帶輻射的強度可用光密度測定來定量。
綜上所述，核酸電泳工作流程采用多種步驟和試劑來分離和分析樣品。為您的樣品選擇合適工具，并識別工作流程的優缺點，可顯著提高分子生物學應用的電泳結果。
參考文獻
1.Stellwagen NC (1998) DNA Gel Electrophoresis. In: Tietz D (editor),?Nucleic Acid Electrophoresis (Springer Lab Manual). Heidelberg: Springer. pp 1–53.
2.Green MR, Sambrook J (2012) Analysis of DNA. In:?Molecular Cloning: A Laboratory Manual?(4th ed). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. pp 81–156.