編者按：
? ? ? ?當聽覺神經系統中對聲音傳導、感知或者綜合分析的各級神經元件發生器質性或者功能性障礙時，就會導致不同程度的聽力減退。耳蝸是聽覺傳導系統的組成部分，將傳入內耳的機械性振動信號轉化成生物電信號。位于耳蝸基底膜上的柯蒂氏器靠近耳蝸中心的一排稱為內毛細胞（IHCs），遠離中心的三排稱為外毛細胞（OHCs）。毛細胞是聽覺系統的感覺受體。自然衰老、藥物治療或者某些特定疾病會造成毛細胞的死亡，進而導致不可逆的聽力損傷。若能使用細胞重編程技術，定向分化為不同功能的IHCs或者OHCs，將能完全逆轉聽力障礙。但目前仍不清楚耳蝸毛細胞編程為IHCs或者OHCs的分子機制。
? ? ? ?耳蝸使用兩種類型的機械感覺細胞來檢測聲音。一排內毛細胞（IHCs）與神經元形成突觸，將感覺信息傳遞給大腦，三排外毛細胞（OHCs）選擇性地放大聽覺輸入。到目前為止，已知有兩種轉錄因子參與了OHCs的特異性分化，但還沒鑒定出在IHCs分化中發揮作用的轉錄因子。
? ? ? ?小編在這里給大家推薦我司客戶美國西北大學范伯格醫學院麻醉科García-A?overos J教授和Anne Duggan教授團隊于2022年5月4日在線發表于《Nature》的研究論文。OHCs的一種轉錄因子INSM1在關鍵的胚胎期起鞏固OHCs命運的作用，可防止OHCs轉分化為IHCs。在沒有INSM1的情況下，胚胎OHCs錯誤表達一組核心IHCs特異性基因，而這些基因經作者預測與IHCs分化有關。作者還發現其中一個基因Tbx2是小鼠IHCs與OHCs分化的主要調節因子。敲除胚胎IHCs中的Tbx2導致其發育為OHCs，表達早期OHCs標記物，如Insm1，在IHCs的位置上最終成為完全成熟的OHCs。此外，Tbx2對Insm1具有上位性：在兩個基因都缺失的情況下，耳蝸只產生OHCs，這表明TBX2對于INSM1缺陷OHCs向IHCs的異常轉分化以及正常IHCs分化是必要的。在出生后分化程度較大的IHCs中敲除Tbx2，使其直接轉分化為OHCs，用成熟和非胚胎OHCs的特征取代IHCs特征。最后，Tbx2在OHCs中的異位表達導致其轉分化為IHCs。因此，Tbx2對于使IHCs區別于OHCs來說既是必要的，也是充分的，并在整個發育過程中保持這種差異。
一、胚胎期敲除Tbx2導致在IHCs位置產生OHCs
? ? ? ?首先作者推測驅動毛細胞轉變為IHCs的特異性分化，應該有三個條件：第一該基因類似于轉錄因子能調控多個基因的表達；第二該基因特異性表達在IHCs，而在OHCs不表達；第三在OHCs向IHCs轉變的過程中該基因由沉默狀態變成活躍狀態。按照這三個條件去篩選，研究人員找到了T-box轉錄因子家族成員-Tbx2。
? ? ? ?通過原位雜交實驗，研究人員發現胚胎期Tbx2表達在小鼠耳蝸骨中膜上皮細胞和柯蒂氏器內隔室細胞（包括IHCs）。但是在柯蒂氏器外隔室細胞（包括OHCs）中幾乎檢測不到Tbx2的表達。因此，進一步研究人員關注Tbx2在IHCs中的功能。
? ? ? ?INSM1是OHCs特異性分化的轉錄因子，當胚胎期INSM1功能不足的情況下，導致毛細胞容易轉化為IHCs。而Tbx2只在INSM1功能不足的導致轉分化的OHCs中表達，而在沒發生轉分化的OHCs中不表達。并且正常發育狀態下，沒有毛細胞能同時表達INSM1和Tbx2兩種分子，因此可以推測Tbx2可能是分化為IHCs的關鍵轉錄因子。
? ? ? ?進一步，使用Atoh1-cre在胚胎期新生毛細胞中條件性敲除Tbx2，發現IHCs位置的毛細胞都表達出OHCs的標記物Insm1和Bcl11b，并降低IHCs的標記物Fgf8、Brip1和Msx1表達。聽性腦干反應（ABRs）檢測也發現IHCs的功能明顯降低。這些IHCs位置的毛細胞，在分子、解剖學和生理學上都沒有IHCs的特征，缺少VGLUT3、CALB2、BK和CtBP2等IHCs的生物標記，而具有Prestin、KCNQ4和PMCA2等OHCs的生物標記。研究人員把這些在IHCs位置上的OHCs稱為ic-OHCs，并確定ic-OHCs展現出OHCs生理學特性，具備完整的OHCs功能。
圖1. 胚胎期條件敲除Tbx2導致IHCs位置上產生OHCs
二、TBX2的調控等級高于INSM1
? ? ? ?上述實驗證明，在胚胎期TBX2功能不足的情況下，IHCs表達INSM1并分化為OHCs，而在INSM1功能不足的情況下，OHCs表達TBX2并轉分化為IHCs。但是對于IHCs轉分化為OHCs是否需要TBX2的參與，OHCs轉分化為IHCs是否需要INSM1的參與這些問題仍不清楚。研究人員構建了INSM1和TBX2的毛細胞雙敲除小鼠，發現在胚胎期敲除這兩個基因之后，所有的毛細胞都分化成OHCs，并且所有的IHCs也轉分化成了OHCs。盡管INSM1功能不足使OHCs容易分化為IHCs，但仍有一半的細胞分化為成熟的OHCs，因此INSM1對于OHCs的分化并不是必不可少的。但是從OHCs轉分化為IHCs的過程中，Tbx2對于IHCs的形成卻是不可或缺的，Tbx2功能不足的OHCs將無法轉分成成為IHCs?；谝陨辖Y果可以得出初步結論：在調控作用上Tbx2的等級高于INSM1。
圖2. TBX2的調控等級高于INSM1
三、胚胎晚期或者出生后敲除Tbx2導致IHCs向OHCs轉分化
? ? ? ?進一步研究發現，Tbx2不僅在IHCs開始分化時是必不可少的，在隨后的分化過程和IHCs細胞狀態的維持也是必需的。在胚胎晚期部分分化的IHCs中條件性敲除Tbx2，將導致敲除Tbx2的IHCs轉分化成為OHCs。類似的，在出生后敲除Tbx2也會導致IHCs轉分化為OHCs。
? ? ? ?免疫組織化學的結果顯示，在出生后敲除Tbx2的最初幾天中，毛細胞分化成的IHCs從出生后的第一天開始表達OHCs標記PMCA2，從第四天開始表達Prestin，而IHCs標記VGLUT3則在第八天表達消失。
? ? ? ?由于胚胎期敲除Tbx2會造成IHCs中Tbx2表達永久性降低，不利于研究IHCs分化的晚期是否需要Tbx2的參與。因此研究人員采用他莫昔芬啟動的Cre-loxp技術，轉基因小鼠在P0、P3、P7和P9的時間點單次注射他莫昔芬后，在不同時間段敲除Tbx2均會導致IHCs向OHCs的轉分化。隨著時間的推移，IHCs標記分子VGLUT3、CALB2、BK和CtBP2的表達明顯降低；而OHCs標記分子prestin、oncomodrin和PMCA2的表達明顯增加。
? ? ? ?因此，Tbx2不僅在胚胎發育過程中細胞特異性分化為IHCs所必須，也是在出生后IHCs的分化和維持所必須，即Tbx2的持續存在可維持IHCs的細胞分子狀態并阻止OHCs相關分子特征的表達。
圖3. 胚胎晚期或出生后Tbx2的敲除導致IHCs轉分化為OHCs
四、在OHCs中表達Tbx2導致其轉分化為IHCs
? ? ? ?上述實驗已經證實，在IHCs中敲除Tbx2會導致IHCs轉分化成OHCs，而在INSM1敲除的OHCs中敲除Tbx2會阻止OHCs轉分化形成IHCs。那么在OHCs中過表達Tbx2是否會介導OHCs轉分化形成IHCs呢？帶著這一問題，研究人員展開了以下實驗。
? ? ? ?構建AAV-TBX2-IRES-mCherry病毒（AAV載體為感染毛細胞的Anc80血清型），通過病毒感染在發育期的毛細胞中特異性表達Tbx2。研究首先在IHCs敲除Tbx2的細胞中部分恢復表達Tbx2，發現敲除Tbx2之后，IHCs轉分化形成OHCs,但是在恢復Tbx2表達的IHCs無法轉分化形成OHCs。隨后將AAV病毒注射到耳蝸OHCs所在的位置上，發現AAV病毒表達的OHCs出現IHCs的分子標記物Vglut3，而OHCs自身的分子標記物Prestin和PMCA2表達顯著減少，在OHCs中過表達Tbx2有利于OHCs轉分化形成IHCs。因此，Tbx2是耳蝸毛細胞分化形成IHCs的充分且必要條件，Tbx2是決定毛細胞向IHCs或OHCs分化的主要調節因子。
圖4. 在OHCs中表達Tbx2導致其轉分化為IHCs
五、小結
綜上所述，研究人員運用多種轉基因小鼠，結合免疫熒光、電生理等研究手段，發現Tbx2是調節IHCs分化的命運決定因子。在Tbx2功能不足的情況下，IHCs不僅失去了其自身的分子標記物和功能特征，還會獲得OHCs的分子標記物和功能特征。本文發現外毛細胞與內毛細胞轉分化的分子機制，若能通過細胞重編程，定向恢復聽力喪失中死亡的細胞，將為聽力喪失患者的聽力恢復帶來新的希望。
本文利用AAV-Anc80構建了Tbx2過表達病毒載體靶向感染毛細胞，用于在發育中的耳蝸培養物中異位表達Tbx2。
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PT-2834 rAAV-CMV-Tbx2-IRES-mCherry-WPREs
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