球體怎么染色， 構(gòu)建成球后染色成了最頭疼的問題
細(xì)胞用了一堆
培養(yǎng)基用了幾套
染的頭都大了，也沒染個(gè)自己滿意的出來
按照下面步鄹1.2.3 ，輕松搞定干細(xì)胞球體染色
一、固定
1.使用寬口徑移液器槍頭輕輕收集球體，并轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中。讓球體沉淀，然后小心吸出上清液。
備注： 用PBS中的1%BSA預(yù)先涂覆尖端和離心管可能有助于確保最大的轉(zhuǎn)移效率。
2. 室溫下將球體放入4% 多聚甲醛 (PFA) 中固定 15-20 分鐘，然后用50mM Tris/HCl (pH7.4) 淬滅 30分鐘。根據(jù)球體的大小，較大的球體可能需要更長的固定時(shí)間。
3. 固定后，用PBS清洗球體3次（每次清洗5分鐘）。
備注：細(xì)胞可以在 4°C 下長期保存（>1 年）。
二、 通透性
1. 將球體在室溫下與 PBS 中的 0.1-1.0% Triton X-100（或其他透化劑）一起孵育3小時(shí)。根據(jù)球體密度和要染色的分子大小調(diào)整透化時(shí)間。
2. 再次用 PBS 清洗球體（清洗3次，每次5分鐘）。
三、 封片
1. 將球體在封閉緩沖液（例如 PBS 中的 1% BSA 和 1% 驢血清）中在室溫下孵育 1 小時(shí)，以減少非特異性染色。
2. 提示：使用產(chǎn)生二抗的動(dòng)物血清可以降低背景。
3. 注意：BSA 通常適用于阻斷步驟，但如果背景噪音較大，則需要進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)測試以獲得給定抗體組合的最佳結(jié)果。
4. 在孵育過程中輕輕攪拌或搖動(dòng)以確保封閉緩沖液均勻分布。
四、染色
1. 制備用 PBS 和封閉緩沖液稀釋的染色溶液（例如，一抗、核染料或熒光探針）。
2. 將球體在染色溶液中孵育 24-72 小時(shí)，溫度為 4°C。長時(shí)間孵育可確保染色劑到達(dá)球體最內(nèi)層的細(xì)胞。
3. 或者，保持球體處于溫和攪拌下（例如，在搖桿或旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上）以增強(qiáng)滲透。
五、洗滌
1. 用 PBS 清洗球體 3-5 次，以去除未結(jié)合的污漬。確保清洗動(dòng)作輕柔，以保持球體的完整性。
六、 復(fù)染
1. 如果需要二抗或復(fù)染（例如，用于檢測一抗或染色其他標(biāo)記物），則將球體與二抗染色溶液在 24°C 下再孵育 48-4 小時(shí)。
2. 添加 Hoechst 33342 并在 2 °C 下再孵育 4 小時(shí)
3. 再用 PBS 清洗 3-5 次。
4. 注意：該協(xié)議可以在這里暫停，并且樣品可以在 4°C 下避光保存數(shù)月。
七、拍照
1. 將染色的球體轉(zhuǎn)移到玻璃載玻片或成像室中，并使用專為 3D 成像設(shè)計(jì)的封固劑。確保封固劑與您的成像方法兼容，并盡量減少自發(fā)熒光。
2. 使用共聚焦、光片或雙光子顯微鏡對(duì)染色的球體進(jìn)行成像，以獲得最佳可視化效果。確保采集設(shè)置（Z 堆疊、激光功率）針對(duì) 3D 樣本進(jìn)行調(diào)整。
推薦產(chǎn)品：
TSCM腫瘤干細(xì)胞成球培養(yǎng)基-無血清 （貨號(hào)：P2401）
培養(yǎng)基優(yōu)勢：
1.大部分腫瘤細(xì)胞株可直接使用TSCM成球
2.可培養(yǎng)復(fù)雜的球體和類器官
3.可維持同質(zhì)腫瘤球的傳代和擴(kuò)增
4.無血清無直接動(dòng)物源蛋白組分，可保持實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)一性和可驗(yàn)證性。
組織/類器官消化酶 （貨號(hào)：SD0013）
本產(chǎn)品能使膠原蛋白和纖維粘連蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)解離，而不損壞細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的完整性。使用本產(chǎn)品進(jìn)行組織消化可以使組織中細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，適用于各種正常和腫瘤組織類器官。