球體怎么染色， 構建成球后染色成了最頭疼的問題
細胞用了一堆
培養基用了幾套
染的頭都大了，也沒染個自己滿意的出來
按照下面步鄹1.2.3 ，輕松搞定干細胞球體染色

一、固定

1.使用寬口徑移液器槍頭輕輕收集球體，并轉移到1.5 mL離心管中。讓球體沉淀，然后小心吸出上清液。

備注： 用PBS中的1%BSA預先涂覆尖端和離心管可能有助于確保最大的轉移效率。

2. 室溫下將球體放入4% 多聚甲醛 (PFA) 中固定 15-20 分鐘，然后用50mM Tris/HCl (pH7.4) 淬滅 30分鐘。根據球體的大小，較大的球體可能需要更長的固定時間。

3. 固定后，用PBS清洗球體3次（每次清洗5分鐘）。

備注：細胞可以在 4°C 下長期保存（>1 年）。

二、 通透性

1. 將球體在室溫下與 PBS 中的 0.1-1.0% Triton X-100（或其他透化劑）一起孵育3小時。根據球體密度和要染色的分子大小調整透化時間。

2. 再次用 PBS 清洗球體（清洗3次，每次5分鐘）。

三、 封片

1. 將球體在封閉緩沖液（例如 PBS 中的 1% BSA 和 1% 驢血清）中在室溫下孵育 1 小時，以減少非特異性染色。

2. 提示：使用產生二抗的動物血清可以降低背景。

3. 注意：BSA 通常適用于阻斷步驟，但如果背景噪音較大，則需要進行經驗測試以獲得給定抗體組合的最佳結果。

4. 在孵育過程中輕輕攪拌或搖動以確保封閉緩沖液均勻分布。

四、染色

1. 制備用 PBS 和封閉緩沖液稀釋的染色溶液（例如，一抗、核染料或熒光探針）。

2. 將球體在染色溶液中孵育 24-72 小時，溫度為 4°C。長時間孵育可確保染色劑到達球體最內層的細胞。

3. 或者，保持球體處于溫和攪拌下（例如，在搖桿或旋轉平臺上）以增強滲透。

五、洗滌

1. 用 PBS 清洗球體 3-5 次，以去除未結合的污漬。確保清洗動作輕柔，以保持球體的完整性。

六、 復染

1. 如果需要二抗或復染（例如，用于檢測一抗或染色其他標記物），則將球體與二抗染色溶液在 24°C 下再孵育 48-4 小時。

2. 添加 Hoechst 33342 并在 2 °C 下再孵育 4 小時

3. 再用 PBS 清洗 3-5 次。

4. 注意：該協議可以在這里暫停，并且樣品可以在 4°C 下避光保存數月。

七、拍照

1. 將染色的球體轉移到玻璃載玻片或成像室中，并使用專為 3D 成像設計的封固劑。確保封固劑與您的成像方法兼容，并盡量減少自發熒光。

2. 使用共聚焦、光片或雙光子顯微鏡對染色的球體進行成像，以獲得最佳可視化效果。確保采集設置（Z 堆疊、激光功率）針對 3D 樣本進行調整。

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