? ? ? ?2022年5月20日，北京大學IDG麥戈文腦科學研究所、心理與認知科學學院、北大-清華生命科學聯合中心王征課題組，在《eLife》在線發表題為“Mapping brain-wide excitatory projectome of primate prefrontal cortex at submicron resolution and comparison with diffusion tractography”的研究論文，報道了團隊在獼猴大腦結合細胞類型特異的病毒標記方法和雙光子成像技術成功構建了獼猴腹外側前額葉（ventrolateral prefrontal cortex, vlPFC）的全腦興奮性投射圖譜，并與在11.7T超高場磁共振上獲得的獼猴全腦神經纖維連接圖譜進行比較，發現獼猴腹外側前額葉與枕葉之間不存在直接的、單突觸神經纖維連接通路。
? ? ? ?神經環路的結構解析是理解大腦高級功能的基礎，可為腦疾病的診斷和治療提供精確的標記和干預靶點，亦可為類腦智能技術提供創新架構和技術模擬的連接基礎。介觀層面重建模式動物大腦的神經環路已被科技創新2030—“腦科學與類腦研究”重大項目列為重要研究方向。介觀水平的環路解析需要利用示蹤劑標記神經元的結構，病毒載體類的示蹤劑具有細胞類型特異性和更高的方向特異性。雖然已經有利用病毒載體研究獼猴大腦功能的報道，但是這些研究并沒有提供軸突投射的路徑信息，所以不同種類的病毒載體在獼猴大腦標記軸突的效率仍然需要系統地測試。自2015年起，王征課題組與中科院徐富強團隊緊密合作，在獼猴大腦測試了多種在小鼠中應用比較成熟的病毒載體包括腺相關病毒（adeno-associated virus, AAV）、水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV）和慢病毒（lentivirus）。結果發現這幾種病毒都可以介導外源基因在獼猴大腦的表達，實現神經細胞胞體的標記（圖1）。VSV-ΔG介導外源基因快速的表達，病毒表達5天便可以高亮地標記神經元胞體和近端凸起（圖1A和B），但并不能觀察到跨腦區的軸突投射，進一步延長表達時間（超過窗口期）導致被感染細胞的凋亡。慢病毒介導外源基因的表達持續且穩定，感染9個月后依然可以觀察到被標記的神經細胞（圖1C和D）。AAV標記軸突的效率相比于VSV-ΔG和慢病毒更高，比較適合在獼猴大腦上開展長程軸突標記（圖2）。傳統的組織切片光學成像往往伴隨嚴重的組織形變，難以實現大范圍的三維重建。近年來蓬勃發展的大尺度三維介觀光學成像比如華中科技大學駱清銘和龔輝教授團隊研創的MOST（顯微光學切片斷層成像系統）技術，都具有高通量自動化的特性，突破傳統技術瓶頸，已經在嚙齒類動物上完美實現了全腦介觀成像。
圖1.不同病毒載體在獼猴大腦的表達
圖2.不同病毒載體在獼猴大腦標記軸突效果的對比
? ? ? ?獼猴腹外側前額葉腦區參與靈活決策、工作記憶等多種高級認知功能。王征實驗室此前在轉基因獼猴模型和臨床患者上的研究成果揭示了腹外側前額葉的異常與認知靈活性損傷密切相關（J Neurosci, 2020; Am J Psychiatry, 2021），并且發現腹外側前額葉的結構與功能網絡特征可用于指導改善臨床病人抑郁、焦慮癥狀的治療方案（J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2021; Mol Psychiatry, 2022）。因此，深入完整地解析腹外側前額葉的神經纖維連接圖譜對全面解析其在腦認知和腦疾病中所扮演的角色至關重要。本研究在獼猴腹外側前額葉注射攜帶興奮性啟動子CaMKIIα及融合報告基因Tau-GFP的腺相關病毒載體（AAV2/9）來選擇性標記興奮性軸突，采用連續光學成像構建了0.95×0.95×200μm空間分辨率的全腦神經纖維投射圖譜（圖3A），發現興奮性軸突主要分布在前額葉內部不同區域，同時投射到顳葉、邊緣系統、腦島、頂葉和部分皮下核團。
? ? ? ?擴散磁共振成像（diffusion MRI）主要利用水分子微觀擴散的各向異性特征建模，以此推斷神經纖維束的空間走向，重建全腦結構連接圖譜（tractography），已廣泛應用于動物和人體，是目前唯一的神經纖維活體示蹤技術。但因其精確性和可靠性亟需驗證，所重建的大腦神經連接圖譜引發了諸多爭議（Science, 2012），也限制了該技術在臨床中的推廣應用。王征課題組對11.7T超高場磁共振成像系統的軟件序列和離體猴腦的成像方法進行優化后，可獲得高達200×200×200μm的擴散磁共振影像數據，將其與病毒標記軸突熒光圖像數據配準到標準猴腦空間（圖3B，Cereb Cortex, 2021），以病毒標記注射的位點作為種子區域進行神經纖維追蹤（圖3C），隨后在同一個空間比較兩種不同模態、尺度的影像數據（圖3D）。結果發現兩種成像模態所得到的神經纖維投射具有較高的相關系數（皮爾遜相關系數為0.4624±0.0922；Dice相關系數為0.4312±0.0861），這為驗證擴散磁共振成像技術提供了新的實驗數據，同時也為橋接宏觀與介觀影像數據空間建立了可行的技術方法。
圖3.構建獼猴腹外側前額葉全腦介觀與宏觀連接圖譜的主要流程
? ? ? ?下額枕束（inferior fronto-occipital fasciculus, IFOF）是一條從額葉如腹外側前額葉、眶額葉等區域出發，經外囊到達枕葉的神經纖維束。早在1909年哈佛大學醫學院解剖學助理Curran解剖人腦白質纖維時就已發現（J Comp Neurol Psychology, 1909），但獼猴大腦的下額枕束是否存在始終沒有定論。研究團隊先利用擴散磁共振成像數據重建了下額枕束的投射路徑，然后與病毒標記的熒光圖像數據相比，發現腹外側前額葉發出的興奮性軸突只在前半腦與下額枕束存在較大的重合，隨后大部終止于顳上回區域，但下額枕束則繼續投射到枕葉部分（圖4）。此結果揭示獼猴腹外側前額葉與枕葉之間不存在直接的、單突觸神經纖維連接，利用擴散磁共振成像技術觀測到的下額枕束可能是一條間接、跨突觸的神經通路，為解析領域內的重大爭議問題提供了新的實驗證據。此外，本研究也為開展獼猴介觀神經連接圖譜研究開辟了一條新路徑。
圖4.獼猴大腦下額枕束IFOF的比較：11.7T超高場磁共振成像與病毒示蹤標記
? ? ? ?中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心（神經科學研究所）鄢明超博士和復旦大學類腦智能科學與技術研究院俞文文為該論文共同第一作者，王征研究員為唯一通訊作者。11.7T超高場磁共振影像數據在復旦大學張江國際腦影像中心完成采集，期間得到了王鶴青年研究員、張孝勇青年研究員的大力支持和幫助。本課題同時與浙江工業大學馮遠靜教授團隊、中國科學院深圳先進技術研究院徐富強研究員緊密合作，得到了科技部科技創新2030-“腦科學與類腦研究”，國家自然科學基金委，中國科學院，上海市，廣東省及北大-清華生命科學聯合中心的資助。本項目所有獼猴的腦影像數據可完全自由共享給感興趣的同行研究者。
參考文獻
? ? ? ?1. Yan MC et al., Mapping brain-wide excitatory projectome of primate prefrontal cortex at submicron resolution and comparison with diffusion tractography, eLife, 2022, 11:e72534..
? ? ? ?2. Cai DC et al., MECP2 duplication causes aberrant GABA pathways, circuits and behaviors in transgenic monkeys: neural mappings to patients with autism, Journal of Neuroscience, 2020, 40(19): 3799-3814.
? ? ? ?3. Zhan YF et al., Diagnostic classification for human autism and obsessive-compulsive disorder based on machine learning from a primate genetic model, American Journal of Psychiatry, 2021, 178(1): 65-76.
? ? ? ?4. Zhang CC et al., Anterior limb of the internal capsule tractography: relationship with capsulotomy outcomes in obsessive-compulsive disorder, Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry, 2021, 92(6): 637-644.
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? ? ? ?8. Curran EJ, A new association fiber tract in the cerebrum with remarks on the fiber tract dissection method of studying the brain, Journal of Comparative Neurology and Psychology, 1909, 19(6): 645-656.
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V03003 VSV-△G-Tau-GFP
PT-0117 AAV2/9-CaMKIIα-Tau-GFP
如需了解AAV在獼猴上表達的詳細情況，請看下篇推文。
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