「DIFF CRO」服務平臺可針對FIPV疫苗及藥物進行有效性評價。在候選藥物的細胞水平篩選階段，可進行真病毒小分子藥篩，另外針對貓傳腹的蛋白酶靶點，「DIFF CRO」獨家開發了蛋白酶抑制劑篩選系統以幫助研發企業加速進程，為早日實現合規獸藥、疫苗上市爭取更多時間。

FIPV真病毒小分子藥篩

針對FIP小分子治療藥物，DIFF CRO搭建了基于真病毒體系的體外藥效篩選平臺，用于系統評估候選化合物對病毒在細胞內復制過程的抑制能力。該平臺采用標準化培養體系和經過驗證的FIPV真病毒株（見表1），在嚴格的生物安全條件下開展實驗，能夠更真實地反映候選藥物在細胞環境中的抗病毒活性（圖6），為早期藥效判斷和化合物優選提供可靠依據。

表1. 使用的FIPV毒株型別

圖6. 某樣品對FIPV WSU79-1146毒株的抑制率曲線

基于DIFF-rGFP系統的FIPV蛋白酶抑制劑篩選

FIPV病毒的多聚蛋白的裂解由兩種蛋白酶調控：主要蛋白酶（3CLpro，也稱為Mpro或nsp5）和木瓜蛋白酶樣蛋白酶（PLpro）。3CLpro在病毒生命周期中發揮的重要作用，使其成為藥物設計的一個有吸引力的重要靶點。而由「DIFF CRO」獨家開發的蛋白酶抑制劑篩選系統（DIFF-rGFP ），可在細胞水平直接模擬病毒自然感染過程，杜絕漏篩和假陽性等情況，在新藥早期發現階段快速篩選大量化合物，其擁有諸多優勢：

1）最簡便：肉眼觀測

DIFF-rGFP可通過肉眼直接觀察藥物反應的熒光變化（圖7），進行定性判斷。

圖7. 使用DIFF-rGFP進行FIPV陽性藥物GC376篩選的熒光變化圖

2）最準確：原理可靠

DIFF-rGFP 是基于特制質粒的共表達機制，以FIPV為例，結合重組綠色熒光蛋白（rGFP）和FIPV的3CL蛋白酶。在該系統中，rGFP序列中嵌入了3CL蛋白酶的特異性切割位點。當3CL蛋白酶功能正常時，會特異性裂解rGFP，導致其熒光功能喪失，熒光強度減弱。相反，當抑制劑有效抑制了3CL蛋白酶的活性時，rGFP無法被切割，維持其完整性并正常發出熒光，熒光強度增強（圖8）。藥物有效性與熒光強度成正相關，是一種更直觀的正向篩選方式。

圖8.DIFF-rGFP工作原理圖

3）快速高效的高通量篩選

系統檢測的熒光值低而信噪比好，可聯合現有藥物庫，一周即可篩選1萬-10萬個抗FIPV藥物候選化合物，快速鎖定有效藥物（圖9）。

圖9. 高通量篩選操作示意圖

4）穩定且可重復

DIFF-rGFP 檢測呈現出更漸進的反應，因為它測量的是熒光強度，而不是直接測量病毒復制情況（圖10）。這種更平穩的反應可能會縮小檢測的動態范圍，但能提供更穩定且可重復的檢測結果。

圖10.DIFF-rGFP檢測的半數有效濃度（EC50）

「DIF CRO」憑借其獨有的DIFF-rGFP蛋白酶抑制劑篩選系統，為FIPV藥物研發提供了簡便直觀、準確可靠、高效快速且穩定可重復的體外藥效評價方案。該平臺將復雜篩選過程轉化為直觀的熒光信號，結合真病毒藥篩，構成多方法評估體系，能極大加速候選化合物的早期發現與優化進程，是助力新一代貓傳腹療法從實驗室走向臨床的關鍵加速器。

參考文獻：

Jin M, et al.Practical approach to development of GS-445124-loaded PLGA nanoparticles for the long-term treatment of feline infectious peritonitis caused by feline coronavirus infection. Int J Pharm. 2025 Apr 15;674:125468.

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