「DIFF CRO」服務(wù)平臺(tái)可針對(duì)FIPV疫苗及藥物進(jìn)行有效性評(píng)價(jià)。在候選藥物的細(xì)胞水平篩選階段，可進(jìn)行真病毒小分子藥篩，另外針對(duì)貓傳腹的蛋白酶靶點(diǎn)，「DIFF CRO」獨(dú)家開發(fā)了蛋白酶抑制劑篩選系統(tǒng)以幫助研發(fā)企業(yè)加速進(jìn)程，為早日實(shí)現(xiàn)合規(guī)獸藥、疫苗上市爭取更多時(shí)間。
FIPV真病毒小分子藥篩
針對(duì)FIP小分子治療藥物，DIFF CRO搭建了基于真病毒體系的體外藥效篩選平臺(tái)，用于系統(tǒng)評(píng)估候選化合物對(duì)病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過程的抑制能力。該平臺(tái)采用標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)體系和經(jīng)過驗(yàn)證的FIPV真病毒株（見表1），在嚴(yán)格的生物安全條件下開展實(shí)驗(yàn)，能夠更真實(shí)地反映候選藥物在細(xì)胞環(huán)境中的抗病毒活性（圖6），為早期藥效判斷和化合物優(yōu)選提供可靠依據(jù)。
表1. 使用的FIPV毒株型別
圖6. 某樣品對(duì)FIPV WSU79-1146毒株的抑制率曲線
基于DIFF-rGFP系統(tǒng)的FIPV蛋白酶抑制劑篩選
FIPV病毒的多聚蛋白的裂解由兩種蛋白酶調(diào)控：主要蛋白酶（3CLpro，也稱為Mpro或nsp5）和木瓜蛋白酶樣蛋白酶（PLpro）。3CLpro在病毒生命周期中發(fā)揮的重要作用，使其成為藥物設(shè)計(jì)的一個(gè)有吸引力的重要靶點(diǎn)。而由「DIFF CRO」獨(dú)家開發(fā)的蛋白酶抑制劑篩選系統(tǒng)（DIFF-rGFP ），可在細(xì)胞水平直接模擬病毒自然感染過程，杜絕漏篩和假陽性等情況，在新藥早期發(fā)現(xiàn)階段快速篩選大量化合物，其擁有諸多優(yōu)勢：
1）最簡便：肉眼觀測
DIFF-rGFP可通過肉眼直接觀察藥物反應(yīng)的熒光變化（圖7），進(jìn)行定性判斷。
圖7. 使用DIFF-rGFP進(jìn)行FIPV陽性藥物GC376篩選的熒光變化圖
2）最準(zhǔn)確：原理可靠
DIFF-rGFP 是基于特制質(zhì)粒的共表達(dá)機(jī)制，以FIPV為例，結(jié)合重組綠色熒光蛋白（rGFP）和FIPV的3CL蛋白酶。在該系統(tǒng)中，rGFP序列中嵌入了3CL蛋白酶的特異性切割位點(diǎn)。當(dāng)3CL蛋白酶功能正常時(shí)，會(huì)特異性裂解rGFP，導(dǎo)致其熒光功能喪失，熒光強(qiáng)度減弱。相反，當(dāng)抑制劑有效抑制了3CL蛋白酶的活性時(shí)，rGFP無法被切割，維持其完整性并正常發(fā)出熒光，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（圖8）。藥物有效性與熒光強(qiáng)度成正相關(guān)，是一種更直觀的正向篩選方式。
圖8.DIFF-rGFP工作原理圖
3）快速高效的高通量篩選
系統(tǒng)檢測的熒光值低而信噪比好，可聯(lián)合現(xiàn)有藥物庫，一周即可篩選1萬-10萬個(gè)抗FIPV藥物候選化合物，快速鎖定有效藥物（圖9）。
圖9. 高通量篩選操作示意圖
4）穩(wěn)定且可重復(fù)
DIFF-rGFP 檢測呈現(xiàn)出更漸進(jìn)的反應(yīng)，因?yàn)樗鼫y量的是熒光強(qiáng)度，而不是直接測量病毒復(fù)制情況（圖10）。這種更平穩(wěn)的反應(yīng)可能會(huì)縮小檢測的動(dòng)態(tài)范圍，但能提供更穩(wěn)定且可重復(fù)的檢測結(jié)果。
圖10.DIFF-rGFP檢測的半數(shù)有效濃度（EC50）
「DIF CRO」憑借其獨(dú)有的DIFF-rGFP蛋白酶抑制劑篩選系統(tǒng)，為FIPV藥物研發(fā)提供了簡便直觀、準(zhǔn)確可靠、高效快速且穩(wěn)定可重復(fù)的體外藥效評(píng)價(jià)方案。該平臺(tái)將復(fù)雜篩選過程轉(zhuǎn)化為直觀的熒光信號(hào)，結(jié)合真病毒藥篩，構(gòu)成多方法評(píng)估體系，能極大加速候選化合物的早期發(fā)現(xiàn)與優(yōu)化進(jìn)程，是助力新一代貓傳腹療法從實(shí)驗(yàn)室走向臨床的關(guān)鍵加速器。
參考文獻(xiàn)：
Jin M, et al.Practical approach to development of GS-445124-loaded PLGA nanoparticles for the long-term treatment of feline infectious peritonitis caused by feline coronavirus infection. Int J Pharm. 2025 Apr 15;674:125468.
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