凝膠電泳是許多分子生物學實驗的重要部分。建立核酸電泳需采取一系列步驟來實現核酸樣品的最佳分離和分析。核酸凝膠電泳工作流程中的關鍵步驟包括:
1.選擇和制備凝膠
a.瓊脂糖凝膠 b.聚丙烯酰胺凝膠 c.凝膠制備中的緩沖液選擇
2.準備標準品和樣品
a.核酸梯度選擇 b.樣品和梯度準備 c.加載染料和緩沖液選擇
3.運行電泳
a.電泳緩沖選擇 b.電壓 c.電泳時間
4.在凝膠中可視化樣品
a.熒光染色 b.紫外陰影
5.記錄凝膠
a.熒光成像 b.射線自顯跡法
圖1.核酸凝膠電泳的5大關鍵步驟。
1.選擇和制備凝膠
瓊脂糖（9012-36-6）和聚丙烯酰胺（9003-05-8）是核酸分離中最常用的兩種凝膠基質。兩種材料都是三維基質，孔徑大小適合核酸分離，且與樣品間無反應?？赏ㄟ^改變基質的百分比來調整孔徑大小，從而有效分離不同大小的核酸。
有關瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺之間的選擇，主要取決于核酸樣品的大小和所希望達到的分辨率，雖然凝膠灌制和樣品回收的方法也可考慮（表1）。瓊脂糖凝膠的孔徑大小非常理想，可分離0.1-25 kb范圍內的核酸分子。聚丙烯酰胺形成的孔徑較小，可用于分離小于1 kb的核酸分子。某些情況下，可采用聚丙烯酰胺凝膠以獲得片段小于100bp的單堿基分辨率[1]。
a.瓊脂糖凝膠
關于凝膠制備，瓊脂糖凝膠通常以粉末形式提供，近年來也有方便的預稱重片可供使用。為簡化工作流程、節省時間，可考慮預制瓊脂糖凝膠，其在某些 市售系統中作為集成單元來運行、可視化和分析。
制備您自己的瓊脂糖凝膠，凝膠比例計算為:
凝膠%(w/v)=(瓊脂糖g/緩沖液ml)x 100%
凝膠灌制時，如果使用了熒光核酸染色劑（溴化乙錠1239-45-8），可在凝膠灌制時加入推薦濃度（例如，溴化乙錠0.5 μg/mL）。
表2為不同長度的DN**段分離提供了推薦的瓊脂糖凝膠百分比[2]。一般而言，較高比例的凝膠便于更小片段、更好的分離和分辨（圖2）。注意，低比例凝膠十分脆弱且難以操作，而高比例凝膠則較渾濁，且會干擾可視化。
圖2.不同百分比的瓊脂糖凝膠中DN**段的流動性。在相同條件下（包括運行時間），在1%、2%和3%瓊脂糖凝膠上分離出相同的DNA階梯。1kb片段用紅色星號表示，以供比較。
瓊脂糖成分
瓊脂糖是一種經過純化的瓊脂，是海洋紅藻細胞壁的碳水化合物結構組成部分。 瓊脂糖是一種分子量約為12萬的無支鏈（線性）聚合物，含有800-1000個單糖。 瓊脂糖鏈由一種重復的異二糖-即-D-半乳糖和3,6-酐-α-L-半乳糖通過1-4糖苷鍵結合而成。 雙糖單位，也稱瓊脂二糖，通過a-1、3連接形成了一個鏈（圖3）。
圖3.瓊脂糖的結構單元。瓊脂糖由400-500個瓊脂二糖單位組成。
瓊脂糖溶液加熱并冷卻后，就會形成凝膠基質。其孔洞直徑從50到200納米不等，由凝膠濃度控制。溫度高于90℃，瓊脂糖便會融化，變成無規卷曲。冷卻后，兩個瓊脂糖鏈形成由氫鍵連接的螺旋纖維。進一步冷卻至膠凝固點以下（通常小于40°C），則會有更多氫鍵連接形成螺旋束網絡，進而形成具有三維網格的凝膠（圖4）[3,4]。 由于氫鍵，瓊脂糖形成的凝膠加熱可逆。因此，通過溶解含有目的片段的凝膠，可提取電泳分離出的核酸。
圖4.通過加熱和冷卻改變溶液中瓊脂糖的結構。
對大于10kbp DNA的提取，低熔點（LMP）的瓊脂糖是較合適的選擇。LMP瓊脂糖在65度左右（1%的凝膠）融化—相對較低的溫度，確保可以溫和地提取凝膠中完整的核酸大分子。 LMP瓊脂糖的低凝膠溫度（~25°C）使其成為凝膠內酶反應的理想選擇（例如，連接）。酶在半固態的瓊脂溶液中處于活躍狀態。
b.聚丙烯酰胺凝膠
聚丙烯酰胺-丙烯酰胺和交聯劑—雙丙烯酰胺（簡稱為“bis”）的組分-可以粉末形式提供，但為了方便通常預先制備成原液。該粉末和液體形式是為大家所知的神經毒素，應使用實驗室防護性設施，小心操作。在凝膠中，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺（以%T表示）的總濃度決定了孔隙大小—通常直徑為20-150納米。百分比越高，孔隙越小，可分辨的分子也更小。表3展示了常用的凝膠比例[2]。
核酸分離，通常采用3–30%（%T）的聚丙烯酰胺凝膠。除%T之外，雙丙烯酰胺（交聯劑）與總丙烯酰胺（%C）的重量百分比是聚丙烯酰胺凝膠孔隙大小和樣品分離的的關鍵（表4）。
%T和%C可以表示為：
%T(w/v)=[(丙烯酰胺+雙丙烯酰胺)g/緩沖液ml]x 100%
%C(w/w)=[雙丙烯酰胺g/(丙烯酰胺+雙丙烯酰胺)g]x 100%
聚丙烯酰胺的基本原理
聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺單體聚合而成的聚合物，通常與雙丙烯酰胺或N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺結合使用。交聯劑雙丙烯酰胺含有兩個單位通過亞甲基橋連的丙烯酰胺。聚合是被TEMED 催化（N,N,N′,N′-四甲基乙二胺）的自由基反應-通常由過硫酸銨（APS）引發（圖 5）。因此，在既定溫度下，APS和/或TEMED的濃度決定了聚合速率。
圖5.丙烯酰胺形成聚丙烯酰胺，雙丙烯酰胺結構展示。雙丙烯酰胺含有兩個單位通過亞甲基橋連的丙烯酰胺（紅色）。
c.凝膠制備中的緩沖液選擇
使用具有導電性的離子溶液制備瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠，確保核酸在電泳過程中具有遷移性。電泳過程中，凝膠和電泳緩沖液通常使用相同類型的緩沖液，以保持相同的pH值和離子強度。核酸電泳常用的兩種緩沖液為Tris-醋酸鹽EDTA （TAE）和Tris-硼酸鹽EDTA （TBE），兩者都有接近中性的pH值，有利于帶負電荷的核酸。
為分析單鏈DNA或RNA，瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠通常在變性條件下制備和運行。變性條件會破壞核酸之間形成的氫鍵，從而減少像發夾環這樣二級結構的形成。因此對RNA分離和分析而言，變性電泳更常用。瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠核酸電泳中常用的變性緩沖液包括:
瓊脂糖：磷酸鈉緩沖液中的乙二醛和DMSO、NaOH-EDTA緩沖液、MOPS緩沖液中的甲醛或甲酰胺等
聚丙烯酰胺: TBE緩沖液中的尿素
2.準備標準品和樣品
a.核酸標準品選擇
當運行凝膠時，含有已知大小的核酸參照樣品通常被稱為標準品、標記或 分子量標準，用于目的樣品大小的估計。 在為給定樣品選擇合適的分子量標準時，需考慮如下因素:
Ladde類型（例如DNA或RNA），片段結構（例如單鏈或雙鏈），構象（例如超螺旋、開環或線性）以確保對遷移進行適當比較
片段的數量和適當的分離形式，用于大小的估計
預期用途，如分子量標準是設計用于定性分析還是精確的定量測定
不同類型凝膠適用的分子量標準（例如，部分預制凝膠推薦設計 特定分子量標準以獲得最佳運行結果）
上樣染料的性質，避免目的條帶模糊（圖6）
上樣緩沖液與使用凝膠的兼容性（例如，緩沖液的鹽濃度會影響樣品的遷移）
早期，DNA的大小標準主要來源于病毒基因組片段(（例如,λφX174）和細菌質粒（如pUC19）的限制內切。該標準物在內切、樣品純度和電泳中帶型的重現性方面存在問題。而后，從連接反應和/或PCR中獲取的含有片段的分子量標準，因具有再現性且可產生預期大小的片段，而備受青睞。如今，因為色譜純化片段實現了質量、帶型、強度和數量等方面的更高控制，被視為分子量標準黃金標準（圖6）。
圖6.DNA 分子量標準差異。 分子量標準 #2由色譜純化的DN**段組成，存在于上佳的上樣緩沖液中，可產生相等或預期強度的條帶，并且不含有條帶污點，無染色陰影。 與此相反，分子量標準 #1采用較老技術制造，并存在于次優組分的緩沖液中。
此外，還設計出室溫下穩定、適合運輸和儲存，以及方便和少環境影響的分子量標準。而預混合，即用型分子量標準也可供選擇—添加了最佳濃度、可直接上樣到凝膠的上樣染料的分子量標準。
注意，由不同制造商生產、描述相同（例如，1kb或100bp）的分子量標準，包含DN**段的數量、大小和密度可能會有所不同（圖7）。使用前，請參考制造商提供的指南和協議，獲取分子量標準組成及其使用用途準確而詳細的說明。
與DNA分子量標準不同，RNA分子量標準通常與含有變性劑的上樣緩沖液一同提供。變性劑可維持RNA的單鏈形式，確保樣品可預測的遷移和分離結果。當運行RNA凝膠電泳時，應避免使用DNA分子量標準，因為雙鏈分離，在變性條件下使用會導致非規則方式分離。
圖7.兩個不同供應商A和B，提供具有相同描述的DNA分子量標準片段組成差異。
b.樣品和標準品準備
須計算上樣到凝膠中的DNA量，以確保目的條帶良好分離，并用于可視化和檢測。雖然用熒光染料足以檢測1-100ng/條帶的DNA，但最小可檢測量取決于所用染料[6]。注意，樣品或標準品的超載會造成條帶污點并遮蓋附近條帶，從而導致條帶分辨不清，特別是片段大小相似時（圖8A）。
圖8.次優樣品分離。 (A) 負載影響條帶分辨率。 (B) 上樣量過低會導致條帶扭曲。
在上樣緩沖液中準備好樣品和分子量標準，其最終的體積通常占膠孔體積的30%。 由于孔底分布不均勻（圖8B），使用較少的上樣體積會導致條帶扭曲。對于含有DNA結合蛋白或粘性末端的樣品，凝膠上樣之前，混合物需加入至含有SDS的上樣染料中一同加熱，因為蛋白質結合以及DN**段之間的相互作用會導致分離效果不佳（圖10B）。