腫瘤干細胞是是一群既具有自我更新能力又具有較強的侵襲遷移的細胞，對腫瘤的存活、增殖、轉移及復發有著重要作用。腫瘤細胞的成球實驗（成球大小及數目）是衡量腫瘤細胞干性的金標準。

腫瘤干細胞成球實驗一般將分選干細胞放在無血清培養基、超低粘附培養皿中進行培養，但也可以細胞系做。惡性程度高的細胞系是很容易成球的，但有的細胞系很困難，所以一般建議用腫瘤干細胞培養，細胞容易成球。

這里不得不提下我們的TSCM腫瘤干細胞培養基啦：
使用此培養基培養細胞球體無需支架，通過貼壁細胞趨向于聚集的特性形成細胞球體，可觀察腫瘤的發生，維持腫瘤體基本特征，是用于 3D 細胞培養的最常見、最通用的無支架方法之一，常用的球體包括胚胎小體、乳腺球、腫瘤球體、肝細胞球和神經球，用于 CSC 研究。此款培養基不含血清，由干細胞生長重組蛋白，維生素，礦物質等組成，添加小分子化合物 AMP,BMP inhibitor，Rock 及 SMOC-2 等抑制雜細胞生長并促進腫瘤干細胞以及惡性細胞株成瘤。

?培養基組合：TSCM-b250ml (P2400) ，細胞生長因子（TSGCS）25ml (P2402)，G/A：
2.5ml(SD0038）

腫瘤干細胞成球培養操作：
? 準備好沒有經過 TC 處理的低吸附培養板，并將培養基按照培養基基礎：生長因子：G/A=50/5/0.5的濃度配制好，預熱后置超凈臺備用；
? 將需要成球的腫瘤干細胞吹成單個懸液后，計數細胞，以 6 孔板為例：常規腫瘤干細胞一孔約 2 萬左右的細胞，混勻 1ml 的 TSCM 完全培養基種入孔里；
? 隔天觀察，若是惡性的腫瘤細胞成球會比較快一般第二天可以看到球體，若第二天看到球體建議隔天補 100-200ul 完全培養基繼續培養，若是生長較慢的腫瘤細胞或者其他類型的干細胞建議每隔 2 天補液一次，直至細胞球體大小在 100um 以上 ；

腫瘤干細胞成球培養傳代與收集：
球體達到 100um 以上，需要進行傳代操作或者分散球體，否則容易造成細胞球體過大，中間層細胞吸收不到營養而潰散；
? 準備好 100um 的細胞篩，離心管，及 4°預冷的 D-PBS，TrypLE Express 或者組織消化酶
? 使用細胞篩過濾培養的腫瘤球懸液，小于 100um 的細胞球會直接通過細胞篩進入離心管，大于 100um的腫瘤球會置于細胞篩之上， 將細胞篩倒扣在離心管上，使用 PBS 反復沖洗細胞篩，使大于 100um 的腫瘤球都沖洗到離心管中，標記好離心管后，離心收集腫瘤球；
?離心方法：腫瘤球浮力較大，一般采用瞬離方法離心，具體操作如下： 離心機溫度調整到是 4°，轉速調到 2500 轉-3000 轉 ，然后等轉速一到達設定的轉速后，再等 5 秒按下停止鍵，終止離心后取出離心管，棄上清。收集沉淀。 ?小于 100um 的腫瘤球可繼續培養；大于 100um 的球體加入可浸沒球體的 TrypLE Express 或者組織消化酶置培養箱消化 10-15 分鐘，消化時間以腫瘤球解離的狀態為準，顯微鏡下可以看到球體已經解體成單細胞懸液或者使用剪掉尖頭的槍頭輕輕吹打，球體成絮狀即可加入 2%的 BSA 終止消化；
?消化后的細胞可以繼續使用低吸附培養板培養球體，或者使用常規的培養瓶進行腫瘤干細胞的二維培
養；

腫瘤干細胞球體的計算方法：
SFE 的計算方法：SFE=每孔中直徑大于 75um 的細胞球的個數 / 每孔中原始接種細胞的總數

腫瘤干細胞球體凍存方法：
一旦腫瘤細胞成球后，若球體小于 100um 不需要消化分散即可凍存，需使用組織凍存液或者類器官凍存液進行凍存效果為佳，程序凍存比免程序凍存更適合腫瘤球的長期保存。