牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA），在體外診斷和生物藥的工業生產使用中，無不熟悉。但是其來源，結構和功能，與其應用的關系，又相對較為陌生。本文結合藥典要求，系統介紹，并進一步了解之。

1、血漿蛋白組成

     不同種屬的血液成分類似，添加有抗凝劑的全血，經過離心，可以去除血細胞，上清為血漿。血漿蛋白是動態且復雜的多蛋白，多分子類型的混合物。血漿分為組分I-V。其中組分II為球蛋白，組分IV為酶類，組分V為白蛋白，其中組分II和V為含量最大的單一性質成分。血漿蛋白最早于1937年，Tiselius通過電泳分離，并分未白蛋白，α、β、γ和δ這五類蛋白。

     根據電泳技術的進步，后續Svensson和Longsworth_[1,2]繼續將血漿球蛋白蛋白分為α1，α2, β1，β2，γ1，γ2。在1973年，Laurell根據瓊脂糖電泳，進一步將血漿蛋白分為13種主要蛋白，白蛋白，脂蛋白，抗胰蛋白，轉鐵蛋白，三種補體蛋白，纖維蛋白原，α1-酸性糖蛋白，珠蛋白，IgG，IgA，IgM球蛋白_[3,4,5]。血漿中的蛋白來源，同樣包含組織分泌的酶蛋白類，如酸性/堿性磷酸酶，淀粉酶，肽酶和核糖核酸酶等_[6]，見下表1：

表1

2、白蛋白結構與功能

人血清白蛋白是一種單鏈的多聚肽，折疊成心形的蛋白，三維構象顯示其包含三個結構域，每個結構與包含A和B兩個亞結構域，總分子量為66.8kDa_[7,8,9]。

白蛋白含有結合位點Sulow's I/II，或者每個結合位點都分別由兩個loop結構形成，進一步形成IIA和IIIA亞基。報道的治療性化合物都是結合在HSA的下述兩個位點上_{[10,11,12,13]}，見下圖1、2。

     實質上，人、牛和大鼠的白蛋白的氨基酸成分也有略微的差異_[14]，見表2。在哺乳動物的白蛋白中，有著甲硫氨酸，甘氨酸和異亮氨酸含量低的特點，但是半胱氨酸、亮氨酸、離子型氨基酸、谷氨酸和賴氨酸含量豐富。因為含有大量的離子殘基，導致白蛋白在pH=7條件下，有著185個離子/分子的高電荷，使白蛋白有很好的溶解性。

     在肝臟中合成的白蛋白不是糖蛋白，僅僅由氨基酸組成，沒有輔基和其他修飾。即便在血漿中的轉甲狀腺素蛋白（前白蛋白，一種專門運送視黃醇和甲狀腺激素T4的白蛋白前體）幾乎沒有糖基基團。也缺乏Asn-X-Ser/Thr這種用于N糖基化修飾的基序。

     在循環系統中的白蛋白，會有非酶類修飾成的糖基化積累，其中有一部分“糖基化修飾”是緊密結合的底物。一些混合的隱蔽的二硫鍵來源于半胱氨酸和谷氨酰胺，除非它們被氧化和消除，否則會被對白蛋白有輕微的影響。在正常人體內，有1%的白蛋白會和葡萄糖形成共價鍵結合。白蛋白的糖修飾含量已經成為白蛋白純度的判斷標準，純凈的白蛋白糖修飾含量不高于0.05%（w/w）_[15]。缺少糖和酪氨酸意味著糖蛋白產生了酸水解成了黑色沉淀物或腐殖質。白蛋白通常是無色的，但是和高鐵血紅素，膽紅素底物親和后的濃縮溶液，會呈現黃色的特點。

表2

     在代謝方面，由于白蛋白足夠大，所以不至于會被腎小球過濾而流失。所以，白蛋白被用來攜帶脂肪酸，甾體化合物，膽紅素和卟啉類化合物等治療性藥物。同時，也可以攜帶納米顆粒，遞送到多種大分子藥物到靶細胞/器官。例如，2005年，FDA通過的抗腫瘤的白蛋白紫杉醇，即是白蛋白攜帶130nm顆粒和低水溶性藥物遞送到乳腺癌組織_[16]。非甾體抗炎藥（NSAID）的活性代謝產物，6-甲氧基-2-萘乙酸，和標記有碘-123的碘非他胺，以白蛋白載體游離于血漿中，穿透血腦屏障，降低了半衰期，在靶組織中富集藥物，且能夠很快清除放射性元素_[17,18]，見下圖3。

圖3

     血漿中的轉運蛋白，包含多種，且能夠分別轉運不同的底物，如白蛋白（Metals, bile pigments, hormones, fatty acids, uric acid, drugs, dyes，游離乙酰膽堿等），α脂蛋白（Phospholipids, cholesterol, fatty acids），Retinol-binding globulin（Retinol (vitamin A)），Immunoglobulins（Homologous antigens），參考下表3：

表3

     鑒于上述白蛋白功能，白蛋白不僅是維持血漿滲透壓和營養平衡的重要球蛋白。血漿中，多種成分也都是通過結合白蛋白進行轉運。所以，人血白蛋白常作為藥物，對手術等類型的病人作為營養補充，或者作為藥物的添加輔料使用。

3、BSA的診斷與檢測

     BSA在醫療診斷傳感器和酶反應等應用非常廣泛。且BSA是作為蛋白定量（如BCA、Bradford）試劑，同時，由于該蛋白的準確、快速、靈敏和可重復性，所以BSA也是免疫化學檢測的標準品溯源最常用的工具試劑?，F在常用的BSA檢測方法含有電化學阻抗譜，近紅外反射光譜，毛細管電泳和光散射等技術。

     人血漿白蛋白與牛血漿白蛋白的結構高度類似。BSA是牛健康、牛奶和肉質的重要標志物。而且在多種工業行業中，也有重要的應用，如藥品，制藥，診斷和食品等。如細胞培養過程中，牛血清作為重要的提取物，能夠促進細胞滲透壓維持與細胞分裂生長，同時，在多種試劑中，BSA都是作為保護性的惰性蛋白，來防止目標蛋白降解，或者能夠降低診斷試劑檢測樣本中的抗干擾成分。

     最初的毛細管電泳法檢測BSA，是基于BSA中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的存在，使之基于差異化熒光技術檢測成為了可能_[19]。目前主要基于Bradford法（總蛋白定量）和ELISA法（特異性BSA）定量蛋白。

     在最新的藥典中，都明確了添加的白蛋白的檢測方法和含量限度。值得注意的是，由于BSA是實驗室常用試劑，其檢測污染頻繁存在，實驗過程中，需要重新清潔所需設備，和獨立實驗環境。我們配備了專用手動操作洗液，能夠保持本底的穩定。

     BSA作為藥物常用輔料，其作為外源蛋白，過量存在也會引發機體免疫反應。依據藥典要求，藥物中的BSA控制限度應<50ppm。所以，賽唐生物開發了牛血清白蛋白ELISA試劑盒（貨號：NEGES0014），對本底要求，最低檢測限，最低定量限，精密度，準確度，干擾成分等性能做了完整分析。標曲范圍為0-100ng/mL；本底OD控制在0.1-0.2之間；S1/Blank＞10；DL和QL：0.0625ng/mL，0.5ng/mL；精密度Intra&Inter CV：＜10%，＜15%；準確度：73.7%-108.3%；且在1%人血清，人白蛋白，1%明膠等基質中的回收率均控制在70%-130%范圍；見圖4、5，表4、5：

圖4

圖5

表4

表5

參考文獻

[1] Svensson, H. Studies on Electrophoresis and Adsorption: I. The Moving Boundary Method in Electrophoresis and its Application to the Study of Proteins. Arkiv för Kemi, Mineralogi och Geologi. 1946. 22A (10):1-156. 

[2] Longsworth, L. G. Diffusion Measurements, at 25℃, of Aqueous Solutions of Amino Acids, Peptides and Sugars. Chem. Rev. 1942. 30(2):323-340.

[3] Tiselius, A. A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures. Transactions of the Faraday Society. 1937. 33:524-531.

[4] Laurell C-B. Electroimmuno assay. Clin Chem. 1973. 19(1):99-102.

[5] R.L. Engle Jr., et al. The Plasma Proteins, 2, Academic Press, New York. 1960. pp184-265.

[6] Frank W Putnam. The Plasma Proteins：Structure, Function, and genetic control. New York.  Second Edition / Volume I. 1975. p39.

[7] A. Jahanban-Esfahlan, et al. Spectroscopic and molecular docking studies on the interaction between N-acetyl cysteine and bovine serum albumin. Biopolymers. 2015. 103:638-645.

[8] J.K. Maurya, et al. A spectroscopic and molecular dynamic approach on the interaction between ionic liquid type gemini surfactant and human serum albumin, Journal of Biomolecular Structure and Dynamics. 2016. 34(10):2130-2145.

[9] N. Maurya, et al. In vitro cytotoxicity and interaction of noscapine with human serum albumin: Effect on structure and esterase activity of HSA. Molecular Pharmaceutics. 2019. 16(3) :952-966.

[10] A. Jahanban-Esfahlan, et al. Investigating the interaction of juglone (5-hydroxy-1, 4-naphthoquinone) with serum albumins using spectroscopic and in silico methods, Journal of the Iranian Chemical Society2017.  7(14):1527-1540.

[11] M. Kumari, et al. Effect of N-butyl-N-methyl-Morpholinium bromide ionic liquid on the conformation stability of human serum albumin. ChemistrySelect. 2017. 2(3):1241-1249.

[12] R. Patel, et al. Esterase activity and conformational changes of bovine serum albumin toward interaction with mephedrone: Spectroscopic and computational studies, Journal of Molecular Recognition. 2018. 31(11):e2734.

[13] Patel, M.U.H. et al. Spectroscopic and molecular modelling analysis of the interaction between ethane-1, 2-diyl bis (N, N-dimethyl-N-hexadecylammoniumacetoxy) dichloride and bovine serum albumin, Luminescence. 2015. 30(8):1233-1241.

[14] Theodore Peters Jr. The Albumin Molecule: Its Structure and Chemical Properties. Biochemistry, Genetics, and Medical Applications. 1995. p. 9-75, I-II.

[15] Hughes, W. L. et al. The Proteins. Academic Press, New York. 1954. 2:663.

[16] A. Jahanban-Esfahlan, et al. A simple improved desolvation method for the rapid preparation of albumin nanoparticles. International Journal of Biological Macromolecules. 2016. 91:703-709.

[17] Kawai, K., et al. Serum protein binding displacement: Theoretical analysis using a hypothetical radiopharmaceutical and experimental analysis with 123I-N-isopropyl-p-iodoamphetamine. Nuclear Medicine and Biology. 2009. 36(1):99e106.

[18] Rimac, H., et al. Displacement of drugs from human serum albumin: From molecular interactions to clinical significance. Current Medicinal Chemistry. 2017. 24(18):1930e1947.

[19] A. Jahanban-Esfahlan, et al. Interaction of glutathione with bovine serum albumin: Spectroscopy and molecular docking. Food Chemistry. 2016. 202:426-431.