ELISA背景介紹

      酶聯免疫吸附實驗（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一種基于抗體-抗原-抗體特異性結合形成三明治復合物的高靈敏度、高特異性的免疫檢測技術。鑒于其發展歷史較久，技術積累成熟，且操作簡便、成本較低、可高通量檢測，廣泛應用于醫學（醫療器械和精密儀器）、生物學、藥學、農業、食品安全等領域。根據使用應用的需要，可以分為直接法，間接法，夾心法和競爭法等。

      根據ELISA的特點，其常見應用有：病毒/細菌/寄生蟲的定性檢測，蛋白抗原定量，抗體效價和信號通路的定性和定量研究；藥物研發與質量控制相關的血液和組織液中的藥物定量，生物制品的效價測定等。

      ELISA的顯著特點有：通過標準曲線，精確定量抗原分子濃度；定性篩查樣本中目標抗原的存在與否；高通量檢測大量樣本；檢測限度達到ng/mL，pg/mL的高靈敏度分析；以及抗原抗體特異性反應的親和能力。

      其中，標準曲線是定量的最終依據，其主要體現的方面有：1.標曲是定量分析的核心依據，通過已知濃度標準品和對應的檢測出信號，擬合成數學模型，來反算樣本濃度；2.通過最低檢測限和最低定量限，線性范圍和重復性，來驗證實驗的可靠；3.根據斜率和截距判斷獨立實驗的正常與否；數據可比性和標準化，來校正數據和減少批間差異。

       在ELISA檢測中，Sum of Squares Error (SSE，誤差平方和) 是數據分析的重要統計量，主要用于評估標準曲線擬合的準確性以及實驗數據的離散程度。表示實際觀測值（實驗數據點）與擬合曲線（如標準曲線）預測值之間的偏差平方和?？梢栽u估標準曲線的擬合優度，SSE越小，說明實際數據點與擬合曲線的偏差越小，曲線擬合效果越好，反之，提示此次實驗模型不恰當；另外，在同一批次ELISA板中，不同標準曲線的SSE應接近，并結合R²等統計項目，來判斷實驗條件的重復性、可靠性和穩定性。見圖1，圖2。

ELISA Blank作用

      Blank孔不僅直接影響SSE的計算（校正OD=實測OD-Blank OD，Blank孔OD值不穩定或異常，會導致校正后的數據偏差增大，從而增加SSE，降低擬合精度。）；Blank孔的較大差異，會體現實驗的系統誤差；高Blank信號導致低濃度標準點的計量為負數，扭曲標準曲線，增大SSE。

      另外，在《酶聯免疫吸附法檢測試劑注冊技術審查指導原則》，《定量檢測試劑分析性能評估指導原則》，EP17-A2和《Immunoassay Devices Guidance for Industry》中，均提到定量檢測中的Blank孔，明確要求ELISA實驗需設置空白孔，并規定其信號應顯著低于最低校準品信號（通常要求Blank OD≤最低校準品OD的50%）；或者要求空白孔用于確定檢測限（LOD），其OD值需滿足：均值+2SD≤低濃度校準品OD值；TMB顯色時450nm波長下OD值一般≤0.1；強調空白孔的重復性（CV值應≤20%）等。

實際應用

      因為免疫實驗的所有形式測量，都需要標準化。所以對Blank孔的控制是ELISA水平重要的具體體現之一。

      賽唐生物歷時10年，在開發E.coli/CHO/293/SC Yeast/HS Yeast/PP Yeast HCP ELISA過程中，長期堅持打磨基礎技術，對Blank本底進行了顯著的控制，下降比例達10倍。并統計上百次實驗數據，發現Blank從0.1，降低到0.05水平，再到0.01水平(見圖3-圖9)。

      與Cygnus相比，本底降低2-10倍，見表1，圖10。為后續藥物ELISA定量檢測，提供了扎實的體系支持。

表1

參考標準

《酶聯免疫吸附法檢測試劑注冊技術審查指導原則》

《定量檢測試劑分析性能評估指導原則》

《EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline—Second Edition》

《Immunoassay Devices Guidance for Industry》