本底“瘦身”計劃：HCP ELISA開發(fā)記-自主發(fā)布-資訊-生物在線

本底“瘦身”計劃：HCP ELISA開發(fā)記

作者：上海賽唐生物技術(shù)有限公司 2025-09-22T00:00 (訪問量:24373)

ELISA背景介紹

酶聯(lián)免疫吸附實驗（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一種基于抗體-抗原-抗體特異性結(jié)合形成三明治復(fù)合物的高靈敏度、高特異性的免疫檢測技術(shù)。鑒于其發(fā)展歷史較久，技術(shù)積累成熟，且操作簡便、成本較低、可高通量檢測，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)（醫(yī)療器械和精密儀器）、生物學(xué)、藥學(xué)、農(nóng)業(yè)、食品安全等領(lǐng)域。根據(jù)使用應(yīng)用的需要，可以分為直接法，間接法，夾心法和競爭法等。

根據(jù)ELISA的特點，其常見應(yīng)用有：病毒/細菌/寄生蟲的定性檢測，蛋白抗原定量，抗體效價和信號通路的定性和定量研究；藥物研發(fā)與質(zhì)量控制相關(guān)的血液和組織液中的藥物定量，生物制品的效價測定等。

ELISA的顯著特點有：通過標準曲線，精確定量抗原分子濃度；定性篩查樣本中目標抗原的存在與否；高通量檢測大量樣本；檢測限度達到ng/mL，pg/mL的高靈敏度分析；以及抗原抗體特異性反應(yīng)的親和能力。

其中，標準曲線是定量的最終依據(jù)，其主要體現(xiàn)的方面有：1.標曲是定量分析的核心依據(jù)，通過已知濃度標準品和對應(yīng)的檢測出信號，擬合成數(shù)學(xué)模型，來反算樣本濃度；2.通過最低檢測限和最低定量限，線性范圍和重復(fù)性，來驗證實驗的可靠；3.根據(jù)斜率和截距判斷獨立實驗的正常與否；數(shù)據(jù)可比性和標準化，來校正數(shù)據(jù)和減少批間差異。

在ELISA檢測中，Sum of Squares Error (SSE，誤差平方和) 是數(shù)據(jù)分析的重要統(tǒng)計量，主要用于評估標準曲線擬合的準確性以及實驗數(shù)據(jù)的離散程度。表示實際觀測值（實驗數(shù)據(jù)點）與擬合曲線（如標準曲線）預(yù)測值之間的偏差平方和。可以評估標準曲線的擬合優(yōu)度，SSE越小，說明實際數(shù)據(jù)點與擬合曲線的偏差越小，曲線擬合效果越好，反之，提示此次實驗?zāi)Ｐ筒磺‘?dāng)；另外，在同一批次ELISA板中，不同標準曲線的SSE應(yīng)接近，并結(jié)合R²等統(tǒng)計項目，來判斷實驗條件的重復(fù)性、可靠性和穩(wěn)定性。見圖1，圖2。

ELISA Blank作用

Blank孔不僅直接影響SSE的計算（校正OD=實測OD-Blank OD，Blank孔OD值不穩(wěn)定或異常，會導(dǎo)致校正后的數(shù)據(jù)偏差增大，從而增加SSE，降低擬合精度。）；Blank孔的較大差異，會體現(xiàn)實驗的系統(tǒng)誤差；高Blank信號導(dǎo)致低濃度標準點的計量為負數(shù)，扭曲標準曲線，增大SSE。

另外，在《酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》，《定量檢測試劑分析性能評估指導(dǎo)原則》，EP17-A2和《Immunoassay Devices Guidance for Industry》中，均提到定量檢測中的Blank孔，明確要求ELISA實驗需設(shè)置空白孔，并規(guī)定其信號應(yīng)顯著低于最低校準品信號（通常要求Blank OD≤最低校準品OD的50%）；或者要求空白孔用于確定檢測限（LOD），其OD值需滿足：均值+2SD≤低濃度校準品OD值；TMB顯色時450nm波長下OD值一般≤0.1；強調(diào)空白孔的重復(fù)性（CV值應(yīng)≤20%）等。

實際應(yīng)用

因為免疫實驗的所有形式測量，都需要標準化。所以對Blank孔的控制是ELISA水平重要的具體體現(xiàn)之一。

賽唐生物歷時10年，在開發(fā)E.coli/CHO/293/SC Yeast/HS Yeast/PP Yeast HCP ELISA過程中，長期堅持打磨基礎(chǔ)技術(shù)，對Blank本底進行了顯著的控制，下降比例達10倍。并統(tǒng)計上百次實驗數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)Blank從0.1，降低到0.05水平，再到0.01水平(見圖3-圖9)。