酵母是生物大分子藥物最常用的表達系統之一。如釀酒酵母、畢赤酵母和漢遜酵母。根據FDA、ICH、CDE等機構規定，和《中國藥典》，USP法規要求，滿足和藥企需求，填補市場空白，賽唐生物開發三種酵母專屬HCP ELISA檢測試劑盒。
背景：
酵母表達系統是一種最常見的真菌表達系統。通常用于傳統疫苗，如疫苗（如乙肝、HPV）、胰島素類、抗體片段（如VHH）；糖蛋白（如EPO）等，相對原核和哺乳動物表達細胞有特殊的優勢。如，可進行翻譯后修飾，如糖基化，易基因修飾，低免疫原性，低生產成本等，見表1.1。
表1.1
酵母對蛋白的糖基化修飾效果較好，又可以分為甲基營養型酵母和非甲基營養型酵母[2]。其中，非甲基營養型酵母，包括釀酒酵母(S288c、A634A、BY4716、CEN.PK、∑1278b、SK1、BJ5464、BY4742 和 W303等)、解脂耶氏酵母(W29、E150、E129、YB423 和 CX161-1B等)。甲基營養型酵母，包括畢赤酵母(Y-11430/X-33 野生型、Mut+ (AOX1+, AOX2+)/Muts (AOX1−, AOX2+)/Mut− (AOX1−, AOX2)甲醇利用不同型、SMD1163 strain (his4pep4prb1)/SMD1165 strain (his4prb1)/SMD1168 strain (his4pep4)蛋白酶活性缺失型、GS115 (his4)/KM71 (Δaox1::SARG4 his4 arg4)/SMD1168 (His4, pep4)組氨酸脫氫酶缺失型)、漢遜酵母(CBS4732 strain (CCY38-22-2，ATCC34438，NRRL-Y-5445) /DL-1 strain (NRRL-Y-7560; ATCC26012)/NCYC495 strain(CBS1976；ATAA14754, NRLLY-1798))[1-3]。
表1.2
表1.3
1.1畢赤酵母表達系統：
甲基營養型酵母是一種優秀的用于生物醫藥和工業酶生產的蛋白表達系統。有著細胞高密度培養、容易使用、快速表達、低成本和翻譯后修飾等優點。
以畢赤酵母為例，該宿主有著甲醇調節的乙醇氧化酶啟動子(PAOX1)，高效的分泌構造，轉錄后修飾和特定培養基中的高密度生長能力[4]。AOX1和AOX2基因編碼的乙醇氧化酶，是甲醇氧化通路中的一個酶。根據其突變類型，可以繼續分出多種類型菌株系。由于該品系酵母含有AOXI啟動子，來代謝甲醇，作為誘導蛋白表達的誘導物。在大批量生產優化后，可以達到20g/L的酶產量。
常用的商業化的畢赤酵母品系有GS115, X-33,Pichia PinkTM和KM71。還有蛋白酶缺陷品系，如SMD1168(his4,pep4,::URA3,ura3)和SMD1168H (pep4)；野生型，如BG10,X-33;糖基化品系，如SuperMan5(HIS4+,Och1-disruption), SuperMan5（HIS4+, pep4, Och1 disruption）；營養缺陷型品系，如PichiaPink™（ade2）, GS115（his4）。配套使用的表達載體有 pJAN-s1（BioGrammatics）, pPICZ（Thermo Fisher Scientific）, pD902/pD905（DNA2.0）。生產的工業酶，有 Alkaline Xylanase（GS115）、Neutral protease I（GS115）、α -Amylase（GS115）、Lipase（GS115）、 phytase（KM71）、Laccase（GS115）、β-glucosidase（GS115）、 Trypsin（GS115）等。
但是酵母表達藥用蛋白的顯著突破，是源于FDA許可的Jetrea®和 Kalbitor®。除此之外，還有Human Insulin(X-33), IgG (ScFv fragment)(X-33), HBsAg(GS115),Recombinant Human Interleukin-6(X-33), Human Parathyroid Hormone(Methylotrophic Pichia strain), Recombinant Human Erythropoietin (rhEPO)(X-33)等[5-7]。
來源于非甲基營養型的釀酒酵母表達系統，雖然已經有部分重組蛋白藥物上市，但是酵母細胞表現出的蛋白過度糖基化、低產量和胞內質粒不穩定等缺點，限制了其應用。所以也會引入CRIPR/Cas9技術，對特定位點進行突變。如在GlycodExpress™技術專利中介紹，通過連續去除釀酒酵母的甘露糖轉移酶(MNN1)和糖基轉移酶基因，增強了N-糖基化同質性，并增加了高爾基體細胞器中的UDP-GlcNAc的轉運能力[8]。
1.2釀酒酵母表達系統：
以啤酒酵母為例，其基因組是1996年第一個被完全測序完成的真核基因組。在工業生產乙醇方面，啤酒酵母細胞，有著pH范圍寬，乙醇和糖濃度高，滲透壓強等眾多特點，優于細菌、其他酵母和絲狀真菌[9]。同時也是最常用的基因表達調節模型，且在信號轉導，衰老，凋亡，代謝，細胞周期控制，細胞程序性死亡，神經退行性疾病，自噬，分泌路徑等重要生物學過程。啤酒酵母生產的異源糖蛋白，會導致異常的過度甘露糖基化，并會導致蛋白活性降低和免疫原性增強。該甘露糖基化修飾的通路，主要與Mnn2p和Mnn11p基因有關。N-糖基化修飾導致蛋白分泌增加[10]。敲除α-1,6-甘露糖轉移酶Och1p，能夠生產出有活性形式的人組織型纖溶酶原激活劑。
1.3漢遜酵母表達系統：
漢遜酵母，即多形漢遜酵母。是一種特殊的甲醇營養型酵母，其構建的系統，可利用強誘導型的啟動子如FMD, MOX, GAP等。表達的異源蛋白可實現糖基化修飾，可利用完全合成培養基進行高密度發酵,其遺傳背景較為清楚,安全又高效的性能使得近年來被越來越多的研究人員作為最有前景的真核表達系統。
漢遜酵母有兩個有效的表達元件：1.啟動外源基因高效表達的載體系統；2.用于篩選標記的特殊基因。其篩選標記含兩類：一、營養缺陷型標記，如URA3、LEU2和HIS4等發生缺失條件無法生長的宿主菌標志基因；二、是顯性選擇標記，如抗G418、抗Zeocin基因等。一般基因缺陷型酵母菌的制備，都是通過化學誘變、雜交或原生質體融合等，來獲得對應的標記基因。
總之，酵母表達系統是一個物美價廉的藥物表達宿主。對于免疫方面，如乙肝疫苗（Engerix-B®）、HPV疫苗（Gardasil®），酵母表達的疫苗有更強的免疫原性，穩定的VLPs結構。
在有相同療效的情況下，酵母表達藥物的成本更低，如門冬胰島素(NovoRapid®)；對于抗體片段類藥物，Such as Obinutuzumab(Gazyva®)、Caplacizumab(Cablivi®)ADCC更強(糖基化優化)，組織穿透性更好；表達細胞因子Epoetin delta(Dynepo®)，也有著更長的半衰期。
綜上，畢赤酵母、釀酒酵母和漢遜酵母在亞洲區域的藥企的應用較為常見，三種酵母在表達水平，分泌效率，糖基化能力及其改造難度，基因修飾能力，適合藥物類型的能特點上，均有較大差異。其各自優缺點比較，和上市藥物表達宿主酵母類型，見表1.2、表1.3。
數據：
2.1標準曲線：
上海賽唐生物藥物殘留相關產品：釀酒酵母HCP，畢赤酵母X-33 HCP，漢遜酵母HCP ELISA Kit，其4PL擬合R²均達到0.999，見圖一。
圖一
2.2 質控數據：
畢赤酵母X-33，漢遜酵母和釀酒酵母HCP標曲調試在0-800ng/mL范圍。測定最低檢測限和最低定量限。并測試三種酵母HCP的交叉反應，和精密度等。另外在特定濃度尿素，鹽濃度和pH條件下，回收率均有優異效果，見表2.1。
表2.1
參考標準：
ICH Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products.
ICH Q7: Good Manufacturing Practice Guide for Active Pharmaceutical Ingredients.
ICH S6 (R1).
EMA: Guideline on Immunogenicity assessment of therapeutic proteins (2017).
FDA: Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products (1997).
參考文獻：
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