來源簡介

     人胚胎腎臟成纖維293細胞，通常指的是HEK 293，HEK-293，293 cells，都是從1970s的一個受孕女性胚胎中分離得到的永生化細胞系[1]。
     1973年，來自荷蘭，萊頓的Alex van der Eb實驗室，第一次將腺病毒DNA轉染進體外培養的293細胞中。1977年，Frank Graham在McMaster大學發表了HEK轉染的文獻，因為恰好HEK細胞已經傳代了293次，所以就命名為HEK293細胞。
     一項關于HEK 293細胞系及其五個衍生細胞系的基因組和轉錄組的全面研究，將HEK 293的轉錄組與人類腎臟、腎上腺、垂體和中樞神經組織的轉錄組進行了比較。發現該細胞的性質與腎上腺更接近[2]。

表達優勢

     經過多年的發展，來源于腎臟的HEK293細胞發展成，廣泛應用的成纖維型，內皮型和上皮型細胞。細胞形態多為三角形或梭形，見圖1。
     使用腺病毒感染HEK293細胞，經過測序驗證發現腺病毒約4.5kbp的左臂基因組，整合到了細胞的19號染色體上[3]。由此，使用腺病毒攜帶不同基因，對HEK293細胞進行改造，生成了適應不同藥物的多種細胞亞株。
     經過十年的發展，目前工業與科研界已經進化出了，293f，293T和293S等類型。見圖2。如上述提到的，在1973年，HEK293，可以感染Ad5腺病毒，篩選永生化細胞；在1984年，HEK293S能夠實現MEN培養基的懸浮生長；在1985年，篩選到溫感的SV40 T細胞大抗原細胞系，增加了SV40起始子的表達量；1993年的HEK293H，該細胞貼壁狀態下，生長迅速，蛋白表達水平高，適應了serum-free medium；隨后，又衍生出了HEK293FT，一種能夠感染慢病毒的neo抗性突變的細胞；2014年，優化出適合商業化大規模培養的HEK293F；期間，HEK293E（EBVA）和HEK2936E，前者能夠表達EBNA-1蛋白，后者能夠表達Gly-Gly-Ala重復區域缺失的EBNA1t蛋白；還有2001年的HEK293FTM，含有穩定轉染的FRT位點和TetR質粒；還有2002年的HEK293SG，2010年的HEK293SGGD，HEK293A，HEK293MSR等適應不同功能和藥物的改造細胞系。其修飾的靶基因與包括細胞增殖、凋亡、中心碳代謝、聚糖譜均一性、糖基化效率、蛋白質折疊、分泌系統、蛋白質表達等功能相關。
     目前哺乳動物表達系統應用最成熟，最廣泛的仍然是CHO表達系統。但是對于快速瞬轉，人物種翻譯后修飾相似性，還有大分子蛋白復合物顆粒的表達，293系統有著核心的優勢。所以，293系統仍然是最有應用潛力的哺乳動物表達系統之一。與CHO的表達優勢比較，見下表1：

表1

基因改造

     因為293的核心優勢，科研與工業界不斷對293基因組進行改造，主要關注細胞凋亡，細胞增殖，細胞中心碳代謝，糖基化，蛋白折疊，蛋白分泌等功能。借助的技術手段主要是通過miRNA和siRNA為主的敲除和敲降抑制，進行蛋白組學分析，做合適表達條件的高通量篩選，見下圖3。

圖3

     基因功能，如Cyclin-dependent kinase like 3 (CDKL3)基因，能夠增強蛋白表達的，促進G1-S轉化的細胞周期基因和促進合成功能的Cytochrome c oxidase subunit 15 (COX15)基因。還有一些細胞生長類的基因，如Cyclin-dependent Kinase inhibitor 2C (CDKN2C)，也是調節G1進程；抑制細胞凋亡蛋白合成的B-cell lymphoma 2 (BCL2)基因；降低脫氫酶激酶活性，并增加細胞質中丙酮酸向乳酸的轉化的Dehydrogenase kinase (PDK)。除此之外，還有敲除高甘露糖修飾的MGAT1基因。其中高頻的甘露糖修飾，會增加藥物的那白被修飾的風險，且更容易被呈遞給免疫細胞，增加藥物的體內清除可能。相關基因類型，如下表2所示。

表2

     基于上述HEK293的功能和應用潛力，賽唐生物開發了HEK293 HCP ELISA（HH-H0019-3A1）試劑盒。該試劑盒的DL與QL可以控制在0.39ng/mL和0.78ng/mL。線性表現優異80-120%，已經證實可適用樣本為重組單抗，雙抗和病毒包裝樣本。數據見下表3：

表3

     同時比較了Cygnus產品，貨號： F650S。在（重組蛋白類型）不同藥物（相同藥物不同純化階段）中的檢出率，有不錯的可比性，見下圖4，5。

                                                  圖4                                                              圖5

     同時，在病毒包裝樣本中，從收獲液，澄清液和病毒濃縮液樣本中，多數高于Cygnus F650S，并遠高于國內平行產品的檢測結果。通過ELISA進一步驗證了客戶HCP清除工藝效率，符合客戶多年純化工藝積淀數據。且由于終產物中的HCP識別純度表現優異，更容易通過藥監局審批。見圖6-9。

                                            圖6                                                                  圖7

                                            圖8                                                                   圖9

     另外，賽唐生物也做了充分的特異性檢測，如核酸酶，胰蛋白酶，BSA，HCP等，極大程度上排除了非特異性識別，見下表4：

表4

     賽唐生物始終堅持以解決實際問題導向，和藥企客戶踏實走好每一步。“權威”無法代替技術去解決實際問題，“金標準”不是唯一，但更要和藥企一起堅持多年的法規積累，ELISA與LC-MS，二者缺一不可。解決不了ELISA問題，遑論解決以此為基礎的LC-MS鑒定問題？腳下懸空很危險，非此即彼不可取。