在細(xì)胞培養(yǎng)的微觀世界里，消化酶如同精準(zhǔn)的 “細(xì)胞解讀者”，肩負(fù)著分離貼壁細(xì)胞、拆解組織屏障的關(guān)鍵使命。今天，我們就來深入探討三種主流消化酶的特性與應(yīng)用，助你在實驗中精準(zhǔn)選擇 “得力助手”。
作為絲氨酸蛋白酶家族的代表，胰蛋白酶憑借對賴氨酸、精氨酸肽鍵的切割能力，成為貼壁細(xì)胞傳代的經(jīng)典之選。它通過水解細(xì)胞表面黏附蛋白（如層粘連蛋白）瓦解細(xì)胞間連接，搭配 EDTA 螯合鈣鎂離子，可顯著提升消化效率。
核心應(yīng)用
?適用細(xì)胞：HEK293、HeLa 等常規(guī)貼壁細(xì)胞。
?使用濃度：0.05%-0.25%（推薦 0.25% 胰酶 + 0.02% EDTA）。
?操作要點：37℃孵育 1-5 分鐘，需用含血清培養(yǎng)基中和殘留酶活性。
注意事項
?? 消化時間需嚴(yán)格把控，避免細(xì)胞膜功能蛋白損傷
?? 消化過程呈現(xiàn) “從貼壁到懸浮” 的典型變化（見圖 1-3）
*0.25%胰酶-0.02% EDTA消化HuH-7(人肝癌細(xì)胞），消化前中后的照片。
圖1：消化前（細(xì)胞貼壁，緊緊挨著）
圖2：消化中（可以看到類似藕斷絲連的現(xiàn)象）
圖3：消化后（細(xì)胞脫落，漂浮，聚團(tuán)）
源自溶組織梭狀芽孢桿菌的膠原酶，是破解結(jié)締組織的 “專業(yè)選手”。它靶向水解膠原蛋白肽鍵，對細(xì)胞損傷極小，尤其適合纖維性組織、上皮及癌組織的分離。根據(jù)組織硬度差異，膠原酶分為多種類型：
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Ⅰ型膠原酶：用于較硬組織（如肝臟、腫瘤組織）。用于上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的分離。用于消化組織中連接部分使其成為單個細(xì) 胞，用于哺乳動細(xì)胞的分離。
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Ⅱ型膠原酶：適用于胰腺、心臟，肝臟，骨，甲狀腺，和唾液腺組織細(xì)胞的分離
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Ⅲ型膠原酶：對所有哺乳動物組織均有消化作用
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Ⅳ型膠原酶：包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。更溫和，用于原代細(xì)胞分離（如內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞）。 濃度：0.1-2 mg/mL，根據(jù)組織類型調(diào)整。
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Ⅴ型膠原酶：包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它可用于胰腺小島組織的分離，將結(jié)締組織分離成單個細(xì)胞。
? 不受鈣鎂離子及血清影響
? 可與透明質(zhì)酸酶聯(lián)用增強(qiáng)效果
? 肝細(xì)胞分離實驗顯示：膠原酶混合物得率與成活率雙高（見下圖）
應(yīng)用舉例：不同酶消化法提取豬原代肝細(xì)胞的效果比較（南京大學(xué)）
周徐倩，董磊*
（南京大學(xué)，江蘇 南京 210023）
不同酶消化法提取豬原代肝細(xì)胞的效果比較[J]．現(xiàn)代畜牧科技，2024，107（4）：53-55． doi：10.19369/j.cnki.2095-9737.2024.04.014．
上述文獻(xiàn)采用離體酶消化法，比較胰蛋白酶、II型膠原酶、IV型膠原酶、II型和IV型膠原酶混合物提取豬原代肝細(xì)胞的效果。結(jié)果顯示，這4種酶消化法均能獲得有功能的肝細(xì)胞，其中膠原酶混合物分離的肝細(xì)胞數(shù)量最多，胰蛋白酶法分離的肝細(xì)胞數(shù)量較少，II型、IV型膠原酶消化法分離的肝細(xì)胞排列整齊、邊界清晰。
需要注意的是，無論使用何種酶消化，均需要精細(xì)地控制酶的用量、消化時間和溫度，避免因消化不充分或過度消化影響細(xì)胞的得率和活性。
這款由蛋白酶、膠原酶等組成的混合酶液，堪稱細(xì)胞消化界的 “多面手”。其溫和特性尤其適合干細(xì)胞、原代細(xì)胞及表面標(biāo)志物檢測場景，無需血清中和即可直接離心，大幅簡化操作流程。
使用注意：不要在溫水浴中解凍本品。
Accutase對37 °C以上溫度敏感，在37 °C下45分鐘后會失活。建議放在冰箱中過夜解凍，或放在一盆冷的自來水中解凍1-1.5小時。
Accutase解凍后，搖動瓶子使溶液混勻。本品無需在使用前加熱。從冰箱中取出后應(yīng)立即使用，用完后放回冰箱。 Accutase融化后4℃保存，至少2個月穩(wěn)定。不可室溫保存。也可分裝成單次用量，放到-80 ℃凍存，有效期2年。
1）適用于絕大多數(shù)原代細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞系的消化，以及昆蟲細(xì)胞；
2）溫和有效的消化，凍存后細(xì)胞具更高復(fù)蘇率；
3）幾分鐘內(nèi)實現(xiàn)粘附細(xì)胞的分離，不需清洗或中和反應(yīng)，節(jié)省細(xì)胞傳代時間；
4）對細(xì)胞消化較為溫和，能增加細(xì)胞產(chǎn)量和存活率；增強(qiáng)細(xì)胞貼壁效率；改善細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞生長特性等。
Accutase與胰酶Trypsin在流式檢測
消化細(xì)胞上的應(yīng)用對比
流式檢測數(shù)據(jù)顯示：凋亡率顯著低于傳統(tǒng)胰酶（見上圖）。
截圖文獻(xiàn)：Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ ＰＩ 法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的影響因素. ＤＯＩ：１０． １６５１９／ ｊ． ｃｎｋｉ． １００４?３１１ｘ． ２０２２． ０６． ０１１２
上述細(xì)胞凋亡流式檢測圖可以看到：對于未處理細(xì)胞而言，與無EDTA 胰酶相比，Accutase能顯著減少凋亡率(２.70％ ｖｓ 18.05％）；而經(jīng)藥物處理的細(xì)胞，Accutase組凋亡率也有一定程度減少（22.32％ ｖｓ26.50％），但差異沒有未處理細(xì)胞大。但都可以看出使用Acuutase處理需要流式檢測的細(xì)胞，優(yōu)勢是很明顯的。
細(xì)胞培養(yǎng)中常用的消化酶還有中性蛋白酶，分散酶，透明質(zhì)酸酶等多種，在此就不再一一展開介紹了。下面總結(jié)一下常用消化酶的選擇依據(jù)：
1. 細(xì)胞類型：
- 常規(guī)傳代細(xì)胞：胰蛋白酶。
- 原代細(xì)胞或干細(xì)胞：膠原酶、Accutase。
2. 組織硬度：
-堅硬組織（腫瘤、肝臟）：Ⅰ型膠原酶。
-柔軟組織（腦、胚胎）：分散酶。
3. 實驗需求：
-需保留表面標(biāo)志物：分散酶或Accutase。
-快速消化：胰酶+EDTA。
?? 常規(guī)傳代首選胰酶，搭配 EDTA 提升效率
?? 原代分離根據(jù)組織類型匹配膠原酶亞型
?? 敏感細(xì)胞或表面標(biāo)志物檢測優(yōu)先 Accutase
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