做肝臟相關研究的小伙伴們，提取小鼠原代肝實質細胞（PHH）是否成了你科研路上的“攔路虎”？
作為肝臟代謝、藥物毒理及肝病機制研究的黃金體外模型，其價值毋庸置疑，但傳統方法的低活率、低純度和不可重復性往往讓人頭疼不已。
別擔心！我們為你帶來了一套標準化的小鼠肝實質細胞提取專用試劑盒，旨在幫你告別“憑經驗做實驗”的時代，即使是新手也能穩定獲得高活率、高純度的細胞。
以下是詳細的實驗操作指南，助你輕松攻克這一難題！
配套試劑：Perfusate I（灌流液 I）、Perfusate II（灌流液 II）、Culture Medium（基礎培養液）、Purification Solution（純化液，Percoll體系）。
必備耗材：蠕動泵、恒溫水浴鍋、手術器械、培養皿、離心管、無菌注射器、70μm無菌濾網。
環境要求：全程在超凈臺進行無菌操作，所有試劑需提前預熱至37℃。
02 動物準備
選用 6–8周齡 的健康小鼠（雌雄不限），實驗前需禁食12小時（不禁水）。
這一操作旨在減少肝內糖原儲備，從而顯著提升后續提取細胞的代謝活性。
關鍵提示：灌流全程需避免氣泡產生，氣泡會導致肝組織局部壞死，大幅降低細胞得率。
1.麻醉固定：腹腔注射麻醉劑，將小鼠仰臥位固定于解剖板，用75%酒精充分消毒腹部皮膚。
2.暴露血管：沿腹中線剪開腹腔，撥開腸道，清晰暴露門靜脈與下腔靜脈。
3.預灌流（Perfusate I）：門靜脈插入灌流針并固定，啟動蠕動泵（流速3–4 mL/min），剪開胸腔下腔靜脈作為流出道。持續灌流直至肝臟完全變為土黃色、血液徹底洗凈（約5–8分鐘）。
作用：洗去血細胞和淤血，松弛肝竇結構。
4.酶消化灌流（Perfusuit II）：切換為含優化消化酶的Perfusate II，保持同等流速繼續灌流8–12分鐘。
觀察指標：當肝臟明顯膨松、包膜起皺、質地變軟時，即可停止灌流。
1.小心完整取下肝臟，轉移至無菌培養皿，剔除膽囊及結締組織。
2.將肝組織剪碎，加入少量基礎培養液，用無菌鑷子輕柔撕扯、吹打，促使細胞充分散出。
3.將細胞懸液過 70μm無菌濾網，去除組織殘渣，收集濾液至離心管。
利用密度梯度離心去除肝星狀細胞、內皮細胞等非實質細胞：
初步離心：濾液500 rpm離心3分鐘（室溫），棄上清，收集細胞沉淀。
重懸疊加：用預冷基礎培養液重懸細胞，緩慢疊加至預配制的Purification Solution梯度液上層。
梯度離心：1500 rpm離心10分鐘（4℃）。肝實質細胞會富集在下層細胞帶，需小心吸取該目標細胞層。
洗滌：加入基礎培養液稀釋洗滌，再次低速離心（500 rpm，3 min），棄上清，完成純化。
用Culture Medium完全培養液重懸細胞，進行臺盼藍染色計數。合格活率應≥85%。
按常規密度 (1×10? 個/mL) 接種至培養板或培養瓶，置于37℃、5% CO?培養箱中。
換液：靜置培養4–6小時后換液，以去除未貼壁的死細胞和雜細胞，隨后進行常規培養或實驗。。
靜置培養前與培養6h后換液細胞狀態
0h時：
1.圓球形、折光極強；大小均一，個頭明顯比其他細胞大；
2.細胞膜完整、圓潤透亮，無皺縮；
3.完全不貼壁，全部漂在培養基里。
培養6h時：
1.從圓形 慢慢攤開，變成多邊形、鵝卵石形態；
2.胞質均勻透亮，很多能看到雙核（肝細胞標志性特征）；
3.細胞邊界清晰，開始互相靠攏成片。
我們的一站式試劑盒整合了提取、純化、培養全流程所需試劑，無需額外采購零散耗材，省心省力！
為了確保實驗萬無一失，請務必關注以下關鍵細節：
● 嚴控消化時間：消化時間過短會導致解離不充分，過長則會造成酶損傷細胞膜，導致死亡率飆升。
● 保持低溫離心：純化步驟的離心必須在 4℃ 進行，以降低細胞代謝損傷，保證活性。
● 全程無菌操作：原代細胞極易受污染，請確保所有試劑與器械嚴格無菌。
