Metabolism (IF=11.9)｜中國藥科大學團隊：線粒體“泄漏”為腦缺血幫兇，揭示神經酰胺介導的mtDNA炎癥機制！

英文標題：Ceramides increase mitochondrial permeabilization to trigger mtDNA-dependent inflammation in astrocytes during brain ischemia

中文標題：腦缺血期間神經酰胺通過增加線粒體通透性觸發星形膠質細胞中依賴線粒體DNA的炎癥反應

發表期刊：Metabolism

影響因子：11.9

腦卒中（腦缺血）是全球致死致殘的首要病因，現有療法因時間窗狹窄及再灌注損傷限制，難以有效阻止神經功能惡化。近年研究表明，神經炎癥是加劇腦損傷的核心機制，而星形膠質細胞作為中樞神經的主要免疫調控者，其炎癥激活的“雙面性”（保護與損傷）尚未明確。該研究揭示在腦缺血期間，神經酰胺通過增加線粒體通透性，觸發星形膠質細胞mtDNA依賴性炎癥。

脂質代謝的擾動被認為與缺血性卒中患者的風險和疾病嚴重程度相關，該研究通過液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)對234例血漿樣本（分為健康組（H組）與缺血性卒中組（IS組））進行偽靶標脂質組學分析，檢測到485種脂質（圖1A）。主成分分析(PCA)顯示兩組總體脂質譜分離有限（圖1B），但正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)篩選出193種差異脂質（圖1C），其中缺血性卒中患者的長鏈神經酰胺(Cer)及二氫神經酰胺（合成中間體）水平顯著升高（圖1D）。綜上可知，神經酰胺的累積可能通過促進細胞凋亡、炎癥或線粒體功能障礙加劇腦損傷。

為了進一步證實腦缺血條件下長鏈神經酰胺的上調，該研究進行永久性大腦中動脈閉塞(pMCAO)小鼠模型及離體氧糖剝奪(OGD)腦切片實驗。研究發現，與假手術組相比，pMCAO小鼠的血清和腦組織中總神經酰胺水平顯著升高（圖2A-B），且OGD處理的離體腦切片也呈現類似趨勢（圖2C）。LC-MS/MS分析證實，pMCAO小鼠血清和腦組織中單個長鏈神經酰胺（圖2D-E）及二氫神經酰胺（合成中間體，圖2F-G）均顯著增加。進一步細胞實驗表明，OGD刺激可特異性誘導原代星形膠質細胞（圖2H）和人膠質母細胞瘤細胞系U251（圖2I）的神經酰胺合成，但對原代神經元無顯著影響（圖2J）。因此，神經酰胺的缺血依賴性生成可能與神經膠質細胞活化相關。

神經酰胺來源于三個主要代謝途徑：鞘氨醇補救途徑，鞘磷脂循環途徑，以及絲氨酸棕櫚酰轉移酶(SPT)介導的從頭合成途徑（圖3A）。在pMCAO小鼠腦組織及OGD處理的星形膠質細胞中，絲氨酸棕櫚酰轉移酶(SPT)相關基因(Sptlc1、Sptlc2)表達顯著上調（圖3B-C），而鞘磷脂循環途徑關鍵酶基因(Smpd2、Smpd3)表達下降。因此，神經酰胺的合成從鞘磷脂水解向從頭合成途徑偏移。進一步實驗顯示，SPT抑制劑肉豆蔻素可顯著抑制OGD誘導的神經酰胺生成（圖3E），而星形膠質細胞中敲低Sptlc2基因亦能減少神經酰胺累積（圖3F），直接驗證了該途徑的核心作用。此外，OGD刺激雖上調神經酰胺降解酶基因（Acer2、Acer3，圖3G），但其代償性調節不足以抵消從頭合成的神經酰胺激增。綜上可知，缺血通過激活星形膠質細胞的SPT介導的從頭合成途徑驅動神經酰胺異常累積，而神經元未參與此過程（圖3D）。

該研究利用C2-神經酰胺（水溶性神經酰胺類似物）處理星形膠質細胞（圖4A），發現其可以直接導致星形膠質細胞再激活。星形膠質細胞中GFAP熒光和Edu染色分析，發現C2-神經酰胺可模擬內源性神經酰胺功能，促使星形膠質細胞再激活，表現為GFAP表達上調（圖4B）、活性氧(ROS)及鈣離子濃度呈劑量依賴性升高（圖4C-D），并促進細胞增殖（圖4E）。這種激活效應獨立于神經酰胺的從頭合成途徑及鞘氨醇1-磷酸代謝。研究發現，在氧糖剝奪(OGD)條件下，星形膠質細胞糖酵解能力顯著受損，而敲低SPT關鍵基因Sptlc2可逆轉這種代謝抑制（圖4G），這就表明神經酰胺通過破壞星形膠質細胞的代謝穩態加劇其功能障礙。綜上可知，C2-神經酰胺通過直接觸發星形膠質細胞活化及代謝紊亂，參與缺血病理進程。

ROS產生和鈣負荷分析顯示，敲除Sptlc2基因可減少氧糖剝奪損傷下星形膠質細胞的活性氧生成和鈣過載（圖5A-B），而外源性神經酰胺的添加可逆轉這一抑制效應，這就表明神經酰胺通過線粒體功能障礙發揮作用。研究還發現，神經酰胺促進線粒體通透性轉換孔(mPTP)開放及膜電位崩潰（圖5C-D），并降低線粒體氧化磷酸化能力（耗氧率OCR，圖5E），但這些異常均被線粒體ROS清除劑SKQ1逆轉，表明氧化應激是核心驅動因素。此外，神經酰胺誘導電壓依賴性陰離子通道VDAC1寡聚化（圖5F），促進線粒體DNA(mtDNA)外泄（圖5H），而OGD誘導的VDAC1寡聚化依賴于神經酰胺合成，因Sptlc2缺陷可阻斷此過程（圖5G）。綜上可知，神經酰胺通過氧化應激破壞線粒體膜完整性，引發類似糖尿病心臟病變的線粒體質量控制失調，最終導致mtDNA逃逸，加劇缺血性損傷。

該研究揭示神經酰胺通過干擾mtDNA代謝驅動缺血性星形膠質細胞炎癥反應的機制。在氧糖剝奪刺激下，星形膠質細胞中DNase II蛋白表達下降（圖6A），且神經酰胺通過降低DNase II熱穩定性進一步減少其豐度，導致mtDNA積累（圖6B-C）；釋放至胞質的mtDNA激活cGAS-STING通路，促進cGAMP生成并招募TBK1，進而磷酸化IRF3和NF-κB（圖6D-F），觸發其核轉位（圖6G）及促炎基因(Il-1β、Il-6、Tnfα)和干擾素基因(Ifnα、Ifnβ、Cxcl10)的轉錄上調（圖6H-I）。但是，敲低Sptlc2基因可阻斷上述炎癥級聯反應，外源性神經酰胺的添加也可逆轉這一抑制效應。因此，神經酰胺的從頭合成是炎癥激活的核心驅動因素（圖6D-I）。缺血通過神經酰胺依賴的DNase II抑制及cGAS-STING通路激活，將線粒體損傷與神經炎癥直接關聯，加劇腦缺血病理進程。

為了確認神經酰胺對體內腦缺血損傷的影響，該研究通過向小鼠側腦室注射AAV9-Sptlc2 shRNA病毒（圖7A），成功敲低腦內Sptlc2基因表達，驗證神經酰胺在體內腦缺血損傷中的關鍵作用。結果顯示，Sptlc2敲低顯著減少缺血半影區神經酰胺生成（圖7C），并減輕腦損傷（圖7D），表現為星形膠質細胞失活（圖7E）、ROS水平下降（圖7F）及胞質mtDNA積累減少（圖7G）。同時，該干預抑制了cGAS活性（圖7H）、STING蛋白表達及IRF3磷酸化（圖7I），進而削弱促炎因子和干擾素相關基因的轉錄（圖7J-K）。這些體內數據與體外星形膠質細胞實驗結果一致，共同證實神經酰胺通過驅動線粒體損傷-mtDNA泄漏-cGAS/STING通路軸，觸發缺血后神經炎癥，而以Sptlc2介導的神經酰胺合成為靶點可有效緩解這一病理進程。

研究證實，在缺血性腦損傷中，星形膠質細胞通過SPTLC2介導的神經酰胺從頭合成，觸發線粒體功能障礙及mtDNA泄漏，進而激活cGAS-STING通路依賴性炎癥反應，最終加劇神經炎癥損傷，而抑制Sptlc2可顯著減輕上述病理過程。該研究發現提出了一種新的藥物干預治療策略，為減輕神經炎癥以及未來開發特異性干預策略提供了新思路。