文章標題：Targeting polyamine metabolism and ferroptosis enhances the efficacy of KRAS-targeted therapy depending on KEAP1 status

發表期刊：nature communications

影響因子：15.7

客戶單位：復旦大學附屬中山醫院

百趣提供服務：新一代代謝組學NGM 2 Pro

研究背景

KRAS突變在胰腺癌、結直腸癌、肺癌等癌癥中高發，雖索托拉西布等KRAS靶向抑制劑已實現臨床突破，但療效常因KEAP1、LKB1等共突變顯著受限。鐵死亡作為一種鐵依賴、以多不飽和脂肪酸過氧化為特征的細胞死亡方式，已被證實可有效克服腫瘤治療耐藥性，且KRAS突變對脂質代謝和抗氧化反應的復雜調控，為通過促進鐵死亡增強KRAS靶向治療效果提供了潛在可能，不過KEAP1突變會破壞KEAP1-NRF2抗氧化通路，可能影響鐵死亡誘導效果。多胺（精胺、亞精胺等）在腫瘤細胞持續增殖中起關鍵作用，其分解代謝關鍵酶SAT1可通過催化多胺乙?；⒔汸AOX氧化生成ROS進而促進鐵死亡，KRAS突變腫瘤細胞常依賴高多胺水平維持增殖，靶向SAT1介導的多胺代謝已成為癌癥治療潛在方向，但該方向在KRAS靶向治療中的應用及KEAP1狀態對其的調控作用尚未得到充分研究，因此本研究旨在通過相關實驗探究基于KEAP1狀態的多胺代謝與鐵死亡在KRAS靶向治療中的作用及機制，為KRAS突變癌癥的精準治療提供理論支持。

研究結論

01. 多胺以KEAP1依賴方式協同增強KRAS抑制劑的療效

通過889種代謝物庫篩選（圖1A），發現精氨酸、鳥氨酸、亞精胺、精胺等多胺類代謝物能顯著增強KRAS抑制劑（索托拉西布、阿達格拉西布）對MIAPACA2細胞的抑制作用（圖1B）。在15種KRASG12C突變細胞系中，10種細胞表現出協同效應，5種無協同效應（圖1D），結合CCLE數據庫分析發現，多胺僅在 KRASMU/KEAP1WT細胞系（如MIAPACA2、H1373）中增強KRAS抑制劑敏感性，在KRASMU/KEAP1MU細胞系（如H23、H2122）中無此作用（圖1E），且該結果在新型KRAS抑制劑(fulzerasib、garsoasib)、泛KRAS抑制劑(BI-2493)和KRASG12D抑制劑(MRTX1133)中均得到驗證。在PAAD和LUAD患者來源類器官(patient-derived organoids, PDOs)中（圖1F-G），亞精胺能顯著增強KRAS抑制劑對 KRASMU/KEAP1WT PDOs的抑制作用（圖1H-I），但對KRASMU/KEAP1MU PDOs無影響（圖1J-K）。功能驗證顯示，敲除MIAPACA2和H1373細胞的KEAP1后，多胺的協同作用消失；在H23細胞中過表達KEAP1，則恢復多胺對KRAS抑制劑的敏感性（圖2A），證實KEAP1狀態是多胺發揮協同作用的關鍵。

圖1. 多胺以KEAP1依賴的方式協同增強KRAS抑制劑的療效

02. KEAP1WT依賴的SAT1上調增強多胺與KRAS抑制劑的協同作用

RNA-seq分析顯示，KRAS抑制劑處理后，KRASMU/KEAP1WT的MIAPACA2和H1373細胞中SAT1（多胺分解代謝關鍵酶）顯著上調，而 KRASMU/KEAP1MU的H23細胞中SAT1顯著下調，多胺合成關鍵酶ODC1在兩組細胞中均下調（圖2C-D）。代謝組學檢測發現，KRAS抑制劑處理后，MIAPACA2和H23細胞中精胺、亞精胺及其乙?；a物（N¹-乙酰精胺、N¹-乙酰亞精胺）水平降低，且H23細胞中乙?；a物的降低更為顯著（圖2E）。SAT1-KO的MIAPACA2細胞中，多胺無法增強KRAS抑制劑的療效；而SAT1-OE的H23細胞中，多胺顯著提升藥物敏感性，但酶活性位點突變的SAT1-Y140F無此作用（圖2G），證實SAT1的酶活性是協同作用的核心。進一步研究顯示，敲除KEAP1可抑制KRAS抑制劑誘導的SAT1上調，過表達KEAP1則可逆轉H23細胞中SAT1的下調（圖2H），且KEAP1突變體同樣能上調SAT1表達，表明KEAP1對SAT1存在負向調控，且該調控在KRAS抑制劑處理后發生逆轉。

圖2. KEAP1WT依賴的SAT1上調增強了多胺與KRAS抑制劑之間的協同作用

03. SAT1介導的多胺分解代謝通過鐵死亡增強KRAS 抑制效果

在MIAPACA2細胞中，多胺與KRAS抑制劑聯合處理后，鐵死亡標志物MDA含量（圖3B）、脂質過氧化水平（圖3C）、細胞內亞鐵離子濃度（圖3D）顯著升高，透射電鏡觀察到線粒體皺縮、嵴消失（圖3E-F），而鐵死亡抑制劑(Fer-1、DFO)可完全阻斷多胺與KRAS抑制劑的協同作用，凋亡或壞死抑制劑無此效果（圖3A）。SAT1-KO的MIAPACA2細胞中，聯合處理未引起鐵死亡標志物的顯著變化；而SAT1-OE的H23細胞中，鐵死亡標志物顯著升高，線粒體損傷加重，但SAT1-Y140F突變體無法誘導該效應（圖3H-L）。此外，多胺的補充可增加細胞內H?O?生成，該效應可被SAT1-KO或PAOX-KO阻斷，證實SAT1介導的多胺N1-乙?；cPAOX介導的乙?；喟费趸磻餐a生H?O?，通過芬頓反應促進鐵死亡，進而增強KRAS抑制劑的細胞毒性。 

圖3. SAT1介導的多胺分解通過鐵死亡增強KRASMU/KEAP1WT中的KRAS抑制效果

04. 通過SAT1介導的多胺代謝與鐵死亡克服藥物耐藥性

通過7個月梯度遞增KRAS抑制劑濃度，成功構建MIAPACA2和H23的耐藥細胞系（IC??較親本細胞升高10倍以上）（圖4A-B）。在MIAPACA2耐藥細胞(KRASMU/KEAP1WT)中，多胺仍能顯著增強KRAS抑制劑的療效；但在H23耐藥細胞(KRASMU/KEAP1MU)中無協同作用（圖4C）。RNA-seq和WB結果顯示，耐藥的MIAPACA2細胞中SAT1仍保持高表達，而耐藥的H23細胞中SAT1表達進一步下調（圖4E-F）。代謝組學分析發現，耐藥細胞中精胺、亞精胺水平降低（與多胺合成關鍵酶ODC1下調一致），且H23耐藥細胞中N¹-乙酰精胺和N¹-乙酰亞精胺的降低更為顯著（圖4G）。聯合處理后，MIAPACA2耐藥細胞的脂質過氧化水平顯著升高（圖4H），證實SAT1介導的多胺代謝與鐵死亡通路可有效克服KRAS靶向治療的耐藥性。

圖4. 通過SAT1介導的多胺代謝和鐵死亡克服藥物耐藥性

05. KRAS抑制劑通過JNK/NRF2/SAT1和JNK/c-Jun/SAT1通路調控SAT1表達

WB分析顯示，KRAS抑制劑處理后，H23細胞(KRASMU/KEAP1MU)中NRF2表達與SAT1同步下調，且磷酸化JNK(p-JNK)和磷酸化c-Jun(p-c-Jun)在MIAPACA2和H23細胞中均顯著上調（圖5A）。JNK抑制劑(JNK-IN-8、JNK-IN-11)可逆轉MIAPACA2細胞中SAT1的上調，同時阻止H23細胞中NRF2的降解和后續SAT1的下調，而NF-κB抑制劑無此效果（圖5B）。ChIP-qPCR和DNA pull-down實驗證實，NRF2和c-Jun均能結合到SAT1的啟動子區域（圖5C-D）；雙熒光素酶報告基因實驗顯示，KRAS抑制劑可增強MIAPACA2細胞中SAT1的轉錄活性（依賴c-Jun結合位點），抑制H23細胞中SAT1的轉錄活性（依賴NRF2結合位點）（圖5F）。免疫熒光染色進一步驗證，MIAPACA2細胞中KRAS抑制劑促進c-Jun與SAT1啟動子結合，而H23細胞中則促進NRF2降解，進而抑制SAT1表達（圖5G-H），表明KRAS抑制劑根據 KEAP1 狀態，通過JNK/c-Jun/SAT1(KEAP1WT)或JNK/NRF2/SAT1(KEAP1MU)雙通路特異性調控SAT1轉錄。

圖5. KRAS抑制劑通過JNK/NRF2/SAT1和JNK/c-Jun/SAT1通路調節SAT1表達

06. 靶向SAT1介導的多胺代謝在體內模型中增強KRAS抑制劑的療效

在KRASMU/KEAP1WT的PAAD和LUAD PDOs中，多胺的補充可增加MDA含量，增強KRAS抑制劑的療效，該效應被SAT1-KO阻斷；在KRASMU/KEAP1MU的PAAD和LUAD PDOs中，僅當SAT1-OE時，多胺才能顯著提升藥物敏感性（圖6C-D）。異種移植模型中，MIAPACA2細胞移植裸鼠經精胺與索托拉西布聯合治療后，腫瘤體積和重量顯著小于藥物單藥組（圖6F-H）；H23細胞移植裸鼠經AAV介導SAT1過表達后，聯合治療顯著抑制腫瘤生長（圖6I-K）。在KRASG12C突變自發性肺癌小鼠模型中（圖6L），聯合治療組的腫瘤經CT掃描顯示幾乎完全消失，小鼠生存期顯著延長（圖6M-N），證實靶向SAT1介導的多胺代謝在體內可有效增強KRAS靶向治療的療效。

圖6. 精確靶向SAT1介導的多胺代謝以增強PDOs、異種移植和自發性肺癌小鼠模型中的KRAS抑制劑效果

研究小結

本研究通過代謝物庫篩選、細胞實驗、體內模型驗證及機制探究，明確多胺可通過SAT1介導的多胺分解代謝促進鐵死亡，進而增強KRAS靶向治療的療效，且該效應依賴KEAP1狀態。具體機制為：在KRASMU/KEAP1WT腫瘤中，KRAS抑制劑激活JNK/c-Jun通路，促進SAT1轉錄；多胺補充后，SAT1催化精胺、亞精胺乙酰化，經PAOX氧化生成H?O?，通過芬頓反應誘導鐵死亡，增強藥物敏感性；在KRASMU/KEAP1MU腫瘤中，KRAS抑制劑激活的JNK通路促進NRF2降解，導致SAT1表達下調，需先通過慢病毒或AAV介導SAT1過表達，多胺才能發揮鐵死亡誘導和藥物增敏作用。該研究還證實，靶向SAT1介導的多胺代謝可有效克服KRAS靶向治療的耐藥性，在患者來源類器官、異種移植模型和自發性肺癌小鼠模型中均展現出顯著的治療效果。綜上，本研究揭示了KEAP1狀態對多胺代謝與KRAS靶向治療協同作用的調控機制，提出以SAT1為核心的精準治療策略，為KRAS突變癌癥（尤其是伴KEAP1共突變的患者）提供了新的治療方向和實驗依據。

圖7. 針對SAT1介導的多胺代謝和鐵死亡，以增強不同KEAP1狀態下KRAS突變癌癥的靶向治療效果

END

張生樂  撰文

  peng 校稿