文章標題：Plasma proteomics identifies S100A8/A9 as a novel biomarker and therapeutic target for fulminant myocarditis
發(fā)表期刊：Journal of Advanced Research
影響因子：13
研究概覽
圖1.研究設計概述
研究背景
心肌炎是一類病因多樣的炎癥性心肌病，致病誘因涵蓋各類微生物感染、自身免疫性疾病、藥物及心臟毒性物質(zhì)。暴發(fā)性心肌炎（Fulminant Myocarditis, FM）是急性心肌炎最危重的臨床表型，以病情快速進展、高致死性為核心特征，已成為全球重大公共衛(wèi)生難題。深入探索其分子發(fā)病機制與針對性治療干預手段，對實現(xiàn) FM 的早期診斷、降低死亡率并優(yōu)化臨床治療策略具有重要意義。
臨床實踐中可常規(guī)檢測多種血漿成分，包括蛋白質(zhì)、小分子物質(zhì)、電解質(zhì)及藥物等，其中蛋白質(zhì)是實驗室檢測最常用的分析類別。血漿蛋白質(zhì)組學憑借高通量、可重復、無創(chuàng)且可定量的技術優(yōu)勢，成為發(fā)掘疾病分子標志物與治療靶點的重要手段。然而當前 FM 的診斷標志物和治療靶點在覆蓋范圍與特異性上仍較為有限，這凸顯了采用血漿蛋白質(zhì)組學方法發(fā)掘其新型生物標志物和干預靶點的關鍵意義。本項大樣本隊列研究旨在分析 FM 患者的血漿蛋白質(zhì)組表達譜，通過對驗證隊列的分析與驗證，最終選定 S100A8/A9 作為暴發(fā)性心肌炎的候選生物標志物及預后指標。
研究結(jié)果
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納入隊列的人口統(tǒng)計學與臨床特征
本研究共納入 260 名研究對象，含健康對照者與暴發(fā)性心肌炎組（FM）、非暴發(fā)性心肌炎組（NFM）、急性心肌梗死組（AMI）、急性失代償性心力衰竭組（ADHF）患者。研究設置發(fā)現(xiàn)隊列與驗證隊列，發(fā)現(xiàn)隊列由健康對照者和 FM 患者組成，驗證隊列則納入健康對照者及 FM、NFM、AMI、ADHF 各組患者，兩個隊列的臨床特征及主要治療方案詳見表 1。
發(fā)現(xiàn)隊列與驗證隊列在年齡、性別分布等人口統(tǒng)計學參數(shù)方面無顯著差異。在兩個隊列中，F(xiàn)M 組的左心室射血分數(shù)（LVEF）均顯著低于健康對照組，同時 FM 組的高敏心肌肌鈣蛋白 I（hs-cTnI）和 N 末端 B 型利鈉肽原（NT-proBNP）水平均呈顯著升高趨勢。
表1.發(fā)現(xiàn)隊列與驗證隊列的基線臨床特征
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暴發(fā)性心肌炎患者血漿蛋白質(zhì)組學揭示固有免疫過度激活與代謝紊亂
首先比較了 51 名健康受試者與 153 名 FM 患者之間的血漿蛋白水平（圖 2A），兩組間存在 45 個差異表達蛋白。此外還比較了同一 FM 患者治療前后、以及處于急性期和恢復期的血漿蛋白質(zhì)組學結(jié)果（圖 2B-C），F(xiàn)M 患者在治療前與治療后組間存在 37 個差異表達蛋白，急性期與恢復期組間存在 70 個差異表達蛋白。
為進一步確定 FM 進展相關的敏感性和特異性血漿蛋白，通過對以下三組蛋白進行交集分析：FM 患者較健康受試者顯著升高的蛋白、治療后較治療前顯著降低的蛋白以及恢復期較急性期顯著降低的蛋白，得到了 24 個重疊蛋白（圖 2D）。對這 24 個重疊蛋白進行了 GO 和 KEGG 富集分析（圖 2E-F），研究結(jié)果表明，固有免疫激活和代謝紊亂是 FM 患者血漿差異表達蛋白的主要特征。此外，利用蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡追蹤了這 24 個重疊蛋白之間可能存在的相互作用（圖 2G），發(fā)現(xiàn)炎癥相關蛋白與代謝相關蛋白存在相互作用，這表明炎癥過度激活與代謝紊亂之間存在關聯(lián)。
圖2.發(fā)現(xiàn)隊列中 FM 患者的血漿蛋白質(zhì)組學綜合分析
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S100A8 和 S100A9 是暴發(fā)性心肌炎（FM）嚴重程度的預測因子
為探究 FM 患者中差異表達蛋白（DEPs）與心功能的關系，分析了 24 種關鍵蛋白的標準強度與 LVEF、hs-cTnI、以及 NT-proBNP 水平之間的相關性（圖 2H）。結(jié)果顯示，S100A8 和 S100A9 的標準強度與心功能指標的相關性最佳。值得注意的是，S100A8 和 S100A9 的標準強度之間存在極強的正相關性。另外檢測了 108 例 FM 患者的炎癥細胞因子水平，并按 S100A8/A9 標準強度的 50 百分位將患者分為低、高強度組，研究結(jié)果表明，與低強度組相比，S100A8/A9 高強度組的 IL-1β、IL-2R、IL-6 和 IL-10 水平顯著升高。綜上所述，這些結(jié)果表明 S100A8/A9 在 FM 發(fā)病機制中對心功能障礙和全身性炎癥具有顯著的促進作用。
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血漿 S100A8/A9 水平對 FM 的診斷效能
為進一步驗證 S100A8/A9 在 FM 患者血漿中的表達升高，并評估其對 FM 的診斷效能，針對上述獨立驗證隊列中的健康對照組、FM 組、NFM 組、AMI 組、ADHF 組的研究對象，開展特異性診斷效能的驗證分析（表 1）。通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）定量分析觀察到，與其他疾病組和健康對照組相比，F(xiàn)M 患者入院樣本中的 S100A8、S100A9 以及 S100A8/A9 水平顯著升高（圖 3A-C）。此外，進行 ROC 分析以評估診斷效能，分析表明入院時測量的血漿 S100A8/A9 水平能有效區(qū)分 FM 患者和 NFM 患者，顯示出較強的診斷性能（圖 3D）。另外，S100A8/A9 對 FM 患者和 AMI 患者具有良好的診斷效能（圖 3E），對 FM 患者和 ADHF 患者的診斷效能更優(yōu)（圖 3F）。研究結(jié)果明確表明，S100A8/A9 對 FM 的診斷性能優(yōu)于單獨的 S100A8 和 S100A9。
為驗證先前的結(jié)果，進一步研究了血漿蛋白（S100A8、S100A9 和 S100A8/A9）與臨床指標（LVEF、hs-cTnI 和 NT-proBNP）之間的相關性。相關性分析顯示，血漿中 S100A8/A9 異二聚體水平與 LVEF 呈強負相關，與血漿 hs-cTnI 呈強正相關，與 NT-proBNP 水平呈強正相關（圖 3G-I）。
根據(jù)住院時長將 FM 患者分為三組，并比較其血漿 S100A8/A9 水平。結(jié)果顯示，住院超過 14 天的 FM 患者入院時的 S100A8/A9 水平顯著高于另外兩組（圖 3J），這表明 S100A8/A9 水平升高與住院時間延長存在關聯(lián)。Kaplan-Meier 生存分析顯示，S100A8/A9 高水平組，其主要結(jié)局（心臟死亡和心臟移植復合終點）和次要結(jié)局（因心力衰竭或心肌炎導致的住院和急診就診）的發(fā)生率顯著更高（圖 3K-L），這提示入院時的血漿 S100A8/A9 水平對 FM 患者具有較好的臨床預后預測價值。
圖3.驗證隊列中血漿 S100A8、S100A9 及 S100A8/A9 的診斷效能評價
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S100A8 和 S100A9 在 FM 小鼠心肌組織中表達升高
為進一步研究暴發(fā)性心肌炎小鼠心肌組織中 S100A8 和 S100A9 的表達變化，本研究采用 CVB3 誘導構(gòu)建 BALB/c 暴發(fā)性心肌炎（FM）小鼠模型。首先，4D-FastDIA 蛋白質(zhì)組學分析結(jié)果顯示，與對照小鼠相比，CVB3 誘導的 FM 小鼠心肌組織中 S100A8 和 S100A9 的蛋白水平顯著升高（圖 4A-C）。實時熒光定量 PCR 和蛋白質(zhì)印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)，CVB3 誘導的 FM 小鼠心臟中，S100A8 和 S100A9 的 mRNA 及蛋白水平均呈顯著升高趨勢（圖 4D-F）。與之前的觀察結(jié)果一致，免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對照組小鼠相比，F(xiàn)M 小鼠心肌組織中 S100A8 和 S100A9 的相對熒光強度顯著增強，且部分 S100A8 和 S100A9 的熒光信號可重疊（圖 4G），這表明小鼠心肌組織中存在 S100A8/A9 異二聚體。此外，通過 ELISA 對小鼠血漿和心肌組織中 S100A8/A9 異二聚體水平進行動態(tài)檢測，結(jié)果表明其水平從 CVB3 感染的第一天開始升高，并在感染后第 7 天顯著達到峰值（圖 4H-I）。
圖4.CVB3 誘導的 FM 小鼠心肌組織中 S100A8 和 S100A9 表達升高
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S100A8/A9 抑制劑可改善 CVB3 誘導的 FM 小鼠的心功能障礙
ABR-238901 作為 S100A8/A9 的抑制劑，能抑制 S100A8/A9 與 TLR4 和 RAGE 的相互作用。為探究 S100A8/A9 阻斷在 FM 中的治療效果，研究人員向 CVB3 誘導的心肌炎小鼠腹腔注射了 ABR-238901（圖 5A）。生存分析顯示，ABR-238901 治療能顯著降低心肌炎小鼠的死亡率（圖 5B）。在誘發(fā)暴發(fā)性心肌炎后，小鼠在 7 天內(nèi)出現(xiàn)快速體重下降，而 ABR-238901 可部分逆轉(zhuǎn)這一情況（圖 5C）。更重要的是，ABR-238901 治療減輕了由病毒感染引起的心功能下降（圖 5D-F）。使用 Millar 導管進行的血流動力學分析顯示了類似的變化（圖 5G-H）。經(jīng) ABR-238901 治療后，心肌炎小鼠的心臟重量與體重比（HW/BW）得到部分恢復（圖 5I），同時心肌組織中心力衰竭標志物腦鈉肽（BNP）的上調(diào)也被顯著抑制（圖 5J）。這些結(jié)果表明，阻斷 S100A8/A9 可緩解急性病毒性心肌炎中的心臟功能障礙。
圖5.ABR?238901 阻斷 S100A8/A9 可改善 CVB3 誘導的心肌炎相關心功能障礙
此外，心臟大體觀察結(jié)果顯示，ABR-238901 處理可減輕心肌炎小鼠的炎癥反應（圖 6A）。盡管 CVB3 介導的急性心肌炎小鼠心肌組織中，IL-1β、IL-2R、IL-6、IL-10、CXCL2、TNF-α、TGF-β 和 NLRP3 的 mRNA 及蛋白水平均顯著升高，但 ABR-238901 能夠顯著緩解這些升高（圖 6B–I）；同時，ABR-238901 還可減弱 CVB3 mRNA 水平的升高，但對 S100A8/A9 自身的 mRNA 水平無顯著影響。為進一步明確小鼠心臟的炎癥浸潤和纖維化情況，進行了 HE 染色和 Masson 三色染色，結(jié)果表明 ABR-238901 可顯著減輕炎癥細胞浸潤和纖維化程度（圖 6J-M）。此外，在病毒性心肌炎期間，ABR-238901 還減輕了中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞在心臟中的浸潤（圖 6N-Q）。
總之，在暴發(fā)性心肌炎期間，S100A8/A9 的釋放增加，通過作用于心肌細胞和先天性免疫細胞中的 TLR4 和 RAGE，導致細胞因子產(chǎn)生增多，進而引發(fā)細胞因子風暴。ABR-238901 等 S100A8/A9 阻斷劑通過特異性阻斷 S100A8/A9 與其受體之間的相互作用，對暴發(fā)性心肌炎發(fā)揮治療作用（圖 6R）。
圖6.ABR?238901 可減輕心肌炎小鼠的炎癥反應
研究結(jié)論
本研究檢測了 FM 患者的血漿蛋白，通過對差異表達蛋白的富集分析，觀察到 FM 患者存在明顯的固有免疫激活和代謝紊亂。在 FM 發(fā)病期間，S100A8、S100A9 以及 S100A8/A9 的水平與心功能指標顯著相關，其中 S100A8/A9 異二聚體被確定為 FM 患者的重要生物標志物，且具有良好的診斷性能。此外，血漿 S100A8/A9 水平升高的 FM 患者，其心源性死亡、心臟移植的發(fā)生率更高，因心力衰竭或心肌炎住院和急診就診的次數(shù)也更多。同時，在 CVB3 誘導的 FM 小鼠心肌組織中，S100A8 和 S100A9 的水平顯著升高；采用 ABR-238901 進行S100A8/A9 阻斷治療，可有效減輕小鼠的急性炎癥反應和心臟功能障礙，從而顯著降低 FM 小鼠的死亡率。